基于桑葚花青素的虾鲜度指示膜的制备及应用

田鑫，郭筱兵，孙凤霞，毛晓英，张连富， ，张建*

1. 石河子大学食品学院（石河子 832000）；2. 江南大学食品学院（无锡 214122）

近年来，随着科技的进步和消费者观念的转变，食品的安全和质量控制引起了全球的广泛关注[1]。鱼、虾等水产品在储运过程中，由于微生物的生长和蛋白质的降解，极易腐败[2]。腐败变质的肉类不仅影响其风味及营养价值，而且还容易引发食源性疾病[3]。

肉类制品腐败过程中，总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量的增加会逐渐使包装内环境变为碱性，导致pH敏感染料颜色改变，这可通过智能比色膜进行监测[4]。

智能传感比色膜由两个重要部分组成，即pH敏感染料和成膜基材。相较于目前使用较多的人工合成指示剂，如溴甲酚绿[5]、溴酚蓝[6]、甲基红[7]等，试验选用的桑葚花青素（mulberry anthocyanin，MA）提取物提取自桑葚果实，是一种天然、无毒的水溶性色素，并且对酸碱度显示出较宽范围的响应，是一种优异的化学指示剂的替代品[8-9]。成膜基材是比色膜的另一大重要组成部分。由醋酸胶膜杆菌生物发酵获得的细菌纤维素（bacterial cellulose，BC）是一种生物聚合物，因其具有高纯度、特殊的网状结构和高比表面积，其在食品工业中有着广泛的应用。然而，目前有关BC应用于包装膜的研究较少，因此，此次试验旨在利用桑葚花青素和BC膜制备一种智能传感比色膜，研究比色膜的结构、形态、对不同pH的颜色响应及氨敏感性等，并将其应用于虾的新鲜度检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑葚、青虾，市售。细菌纤维素膜，桂林奇宏科技有限公司。氧化镁、盐酸、氨水等试剂，分析纯，国药集团有限公司。

1.2 仪器与设备

SP-752PC型紫外分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；RE-3000型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；JSM-6490LV扫描电子显微镜（日本电子公司）；Bruker Vertex 70V傅里叶红外光谱仪（德国Bruker公司）。

1.3 方法

1.3.1 桑葚花青素的提取

参考陈杰等[10]的方法，将桑葚烘干至恒重，经粉碎机粉碎后过0.250 mm直径筛，备用。用体积分

数60%的乙醇溶液作为提取剂，按照料液比1∶20（g/mL）于50 ℃水浴3 h，滤液在35 ℃下避光旋蒸，冻干后得到桑葚花青素粉。所得粉末在4 ℃下避光保存。

1.3.2 MA溶液的可见光谱

将1 mL 0.08 g/100 mL的MA溶液分别添加到5 mL pH 4～13的缓冲溶液中，记录其颜色变化。利用紫外-可见分光光度计测量其在400～800 nm的可见光谱。

1.3.3 智能比色膜的制备

将BC膜在蒸馏水中保存3 d，每天更换1次水，除去膜表面的防腐剂与其他杂质。分别将BC膜浸入质量浓度为0.08，0.16及0.24 g/100 mL的MA溶液中30 min，在25 ℃下干燥12 h，制得的比色膜分别命名为BCMA-1，BC-MA-2和BC-MA-3。将另一段BC膜浸泡在无MA的蒸馏水中，然后以相同方式干燥，比较其形态与结构特征。制备的指示膜在4 ℃下避光保存。

1.3.4 智能比色膜的表征

1.3.4.1 智能比色膜的微观结构

利用JSM-6490LV场发射扫描电镜观察纯BC膜及BC-MA指示膜的表面及横截面形态。在分析之前，通过银胶将样品收集在铝基上，对样品进行真空喷金，观测横截面之前先用液氮对膜冷冻断裂。每幅图像的加速电压和工作距离分别为15 kV和1～5 mm。

1.3.4.2 傅里叶变换红外光谱分析

用傅里叶红外光谱（Fourier transform infrared spectrometer，FT-IR）仪测定膜的吸收光谱，扫描次数为32，分辨率为4 cm-1，测量范围为400～4 000 cm-1。

1.3.4.3 膜的比色分析

用扫描仪记录指示膜在pH 4～13缓冲溶液下的颜色变化。用色度计提取指示膜的L*、a*、b*值。按式（1）计算总色差ΔE。

式中：ΔL*=L*-L0*，Δa*=a*-a0*，Δb*=b*-b0*；L*、a*、b*为不同pH下指示膜的值；L0*、a0*、b0*为指示膜的初始值。

1.3.4.4 氨敏感性

向500 mL锥形瓶中装入80 mL 8 mmol/L的氨水，并将膜（20 mm×20 mm）悬置于液面上方1 cm处。在25 ℃下，使用扫描仪采集膜的图像信息，每4 min一次，共24 min。用Photoshop提取膜的图像特征信号，以中心点周围半径为100的像素点的R、G、B平均值作为传感膜的表征值，根据式（2）～（5）计算SRGB值，利用传感膜的RGB总变化率SRGB表征其灵敏度。

式中：Ra、Ga、Ba为膜反应前的初始值；Rb、Gb、Bb为反应后的值。

1.3.5 智能比色膜在虾鲜度检测中的应用

为了测试智能指示膜用于虾新鲜度检测的性能，将新鲜虾密封在无菌培养皿中，将制备的智能指示膜（20 mm×20 mm）贴在盖子内部且不与样品接触。然后在4 ℃下保藏6 d，分别记录第0，第2，第4和第6天的虾样品的化学和微生物特性。每天用数码相机记录智能指示膜的颜色变化，颜色参数测定方法同1.3.4.3。

1.3.5.1 菌落总数

按照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》[11]对鲜虾贮存期间的菌落总数（total viable count，TVC）进行测定。

1.3.5.2 TVB-N测定

按照GB 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》[12]中的半微量滴定法对鲜虾的挥发性盐基氮进行测定。

1.3.6 数据统计与分析

应用SPSS、Origin 9.0软件进行数据处理，利用方差分析进行显著性差异分析，p＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 桑葚花青素在不同pH下的可见光谱

为了验证桑葚花青素作为pH指示材料的可行性，测试了MA溶液在不同pH下的颜色变化。由图1（A）可见，MA溶液在pH低于7时呈粉红色。当溶液变为碱性时，即pH 7～9时逐渐变为紫色，在pH 10时呈黄色，在pH 11～12由棕色变为灰色，pH 13时变为绿色。同时，随着pH由酸到碱，MA的最大吸收峰由530 nm红移至580 nm附近。这些变化主要归因于花青素化学结构的转变[13]，当溶液由酸到碱时，黄色盐离子形式存在的花色苷逐渐转变为醌型，进而转变为无色假碱，最后在强碱性环境中降解。色素溶液在弱酸性、中性和碱性pH下可以完全区分，该范围适合跟踪肉类产品的变质。

图1 MA溶液pH 4～13的颜色及可见光谱

2.2 比色膜的表征

2.2.1 微观结构

通过扫描电镜观察了掺入MA前后BC膜微观形貌的变化。研究发现不同花青素添加浓度的比色膜的表面结构没有显著性差异。从图2（A）中可以看出，纯BC膜表面光滑致密，具有清晰可见的纤维网状结构。BC纳米纤维的直径为70～90 nm，这种多孔网状结构有助于花青素的包埋。纯BC膜经MA溶液浸泡，保留了BC膜的纳米纤维结构，但其表面变得粗糙（图2B），同时观察到一些白色颗粒附着在膜的纤维结构上，表明花青素与BC膜已经成功复合。纯BC膜的横截面（图2C）与表面具有类似的致密纤维结构。当纯BC膜与色素复合后，纤维结构不再明显，但仍保持了高的孔隙率（图2D），这有助于虾腐败产生的挥发性气体的扩散，从而与膜中的pH敏感染料发生反应。

图2 比色膜的扫描电镜图像

2.2.2 傅里叶变换红外光谱分析

FT-IR分析用于表征BC的化学结构并确定其与MA可能存在的相互作用。图3为花青素、纯BC膜以及复合不同浓度桑葚花青素BC膜的FT-IR谱图。复合色素后膜的光谱中3 341～2 898和1 426～1 033 cm-1等类似位置均观察到BC的特征谱带[14]，表明MA对BC的分子结构没有影响。在MA的谱带中，3 100～2 800 cm-1之间的峰、1 709 cm-1和1 351 cm-1处的峰是识别羧基的3个特征峰[15]。对比纯BC膜和MA-BC膜的谱带发现，当BC膜浸入MA溶液后，随着溶液浓度的升高，膜在1 709 cm-1处谱带的强度略有升高，这些变化表明BC膜与花色苷分子之间形成了新的分子间氢键。

图3 基材及膜的FT-IR谱图

2.2.3 比色膜对不同pH的颜色响应

图4是比色膜在不同pH下的颜色响应。在pH 4时，比色膜呈现出与膜初始颜色最相近的粉红色，随着pH的增加，膜的颜色由粉变红再变紫，在pH 10时变为棕色，pH 11～13时膜呈现出由灰色到墨绿色的变化趋势。

图4 MA-BC比色膜在不同pH下的颜色变化

MA-BC膜的亮度（L值）随着pH的升高而降低，表明指示膜颜色随着pH的增加而逐渐变暗。随着pH的增加，指示膜的a值显著降低，由pH 4时的最高值44降低至pH 13时的最低值0，表明膜有由红至绿的变化趋势。b值在不同pH下没有显著变化。Pourjavaher等[16]的研究指出当总色差（ΔE）＞5时，人眼可以感知出颜色的变化。与初始膜的色度参数比较，MA-BC指示膜的色差值ΔE在pH 6～9的范围内大于15，人可以轻松通过肉眼分辨出其颜色变化，因此膜适合用于监测包装环境内pH的变化。

2.2.4 指示膜的氨敏感性

为了模拟所制备的MA-BC比色膜对虾变质期间产生的挥发性化合物的响应，测量了指示膜对氨气的反应速度和敏感性。图5（A）是不同浓度桑葚花青素指示膜对8 mmol/L氨气在24 min内的颜色响应。MA-BC-2膜的SRGB值在前4 min内显著增加，表明其对氨气响应有高灵敏度，在12 min时显示出最高灵敏度48.77%。MA-BC-1膜的灵敏度较低，24 min时灵敏度为22.86%。从图5（B）可以看出，桑葚花青素添加浓度最高的MA-BC-3膜的颜色几乎没有发生变化，呈现出最低的灵敏度。MA-BC-2膜呈现出对氨气的最佳响应灵敏性。

图5 MA-BC指示膜对8 mmol/L氨气在24 min内的响应

此次试验利用0.16 g/100 mL桑葚花青素制备的智能比色膜在不同pH下具有明显的颜色响应，且对氨气有最佳响应灵敏性。因此将MA-BC-2膜用于虾的新鲜度监测。

2.3 比色膜用于虾新鲜度指示

2.3.1 虾新鲜度测定

当TVC值超过6 log10CFU/g时，肉腐败变质且不可食用[17]。如图6（A）所示，4 ℃下虾的TVC值在储藏期内显著升高。第0天时初始TVC值为4.47 log10CFU/g，表明样品新鲜可食用，第4天时TVC值上升至6.58 log10CFU/g，超过了6 log10CFU/g的腐败阈值，证明此时样品已经腐败且不可食用。

图6 4 ℃下虾的TVC（A）、TVB-N（B）的变化和比色膜的颜色变化（B）的变化

鲜虾的TVB-N小于12 mg/100 g为新鲜，12～25 mg/100 g为可食用中等新鲜，大于25 mg/100 g为不可食用的腐败虾[18]。由图6（B）可以发现，新鲜虾的初始TVB-N值为8.58 mg/100 g，在2 d后增加至13.64 mg/100 g，为中等鲜度，在第4天和第6天分别增加至25.89和33.54 mg/100 g。综上，虾的TVC值和TVB-N值均在第4天超过腐败阈值，表明虾在4 ℃下贮藏的第4天已经腐败。

MA-BC-2比色膜用于虾新鲜度监测其颜色及色差值变化如图6（B）所示，第0天时膜呈初始的粉红色，第2天时红色加深，到第4天时，青虾腐败，此时指示膜变为浅紫色。第6天时变为深紫色，ΔE达到最大值34.33（大于5）。明显的颜色变化表明MA-BC-2膜可以用于虾新鲜度监测。

2.3.2 相关性分析

虾腐败过程中产生的挥发性碱性气体会导致比色膜发生颜色变化。从图6（B）可以看出，ΔE与TVB-N值表现出相同的增加趋势，因此对比色膜ΔE值与虾腐败过程中的TVB-N值进行相关性分析。结果表明，虾样品的TVB-N值与指示膜的ΔE值之间的相关性R=0.982，线性多项式模型和模型的精度R2=0.964 5（图7）。说明薄膜的颜色变化与挥发性化合物的产生存在显著正相关，表明MA-BC-2膜可用于虾的新鲜度监测。

图7 虾的TVB-N与比色膜的ΔE之间的相关性（破折号）和最佳拟合模型（点）

3 结论

试验利用BC膜和桑葚花青素制备了用于虾新鲜度指示的智能传感比色膜。结果表明：花青素被成功复合到BC膜上，且与BC膜之间形成新的相互作用，膜的性质稳定，且具有良好的氨敏感性，并在不同pH下呈现出最佳颜色变化；其中MA-BC-2膜具有最佳的氨敏感性，将其用于虾新鲜度指示，当虾在4 ℃下贮藏到第4天时，虾的TVB-N、TVC分别达到腐败阈值，同时膜的颜色由浅粉色变为红色，最后变为紫色。综上：利用0.16 g/100 mL MA溶液与BC膜复合制备的智能传感比色膜（MA-BC-2）可以用于智能包装的指示标签，且在食品的货架期指示方面具有良好的应用前景。