铁皮石斛中SOD提取纯化及其在发酵食品中应用

谢余岚，张婷，姜梦奇，罗静静，张珍林，

1. 皖西学院生物与制药工程学院（六安 237012）；2. 植物细胞工程安徽省工程技术研究中心（六安 237012）；3. 安徽省中药资源保护与持续利用工程实验室（六安 237012）

铁皮石斛（Dendrobium officinale）又称黑节草，属于兰科，多年生附生型草本植物，主要分布于安徽、浙江、福州、广西、四川、云南等地[1]。铁皮石斛是一种珍稀中药材，SOD是机体内超氧阴离子自由基的清除剂，在机体内催化超氧阴离子歧化生成过氧化氢和氧气[2]，减少自由基对机体影响，具有抗衰老、调节机体、抑制肿瘤生长、调节血脂和美容等功效[3-5]，研究发现在某些蔬菜和一些水果中含有较为丰富的SOD；含有SOD的水果和蔬菜的储存时间长于不含SOD的水果和蔬菜，食物中维生素C含量也有所增加，可以延长食物的腐败时间，因此有望将其应用于易腐败食品工业[6]。

在不同原料中，SOD提取的工艺方法有多种[7]，将提取的SOD进行实际应用研究也有很多[8-9]。此次研究在以大别山产石斛为原料的基础上结合查阅资料，用1年生铁皮石斛为原料，采用较为简单的热变性法进行提取，用磷酸分级沉淀进行提纯，研究其在不同温度下的活性，并将其应用到发酵食品中，有助于提升不同生物中SOD的利用，扩大SOD多方面用途的影响力，同时为研究石斛的多方面应用价值、深入探索石斛在未来食品应用方面的用途提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

铁皮石斛；磷酸二氢钾；磷酸氢二钾；硫酸铵晶体；邻苯三酚；自来水；纯牛奶、酸奶（均为市售）。

1.2 仪器与设备

电子天平（BS 200 S-WE 1）；水浴锅（DK-S 24型）；匀浆机（JJ-2组织捣碎匀浆机）；分光光度仪（UV-1600）；离心机（H-1850 R）。

1.3 试验方法

1.3.1 铁皮石斛SOD的提取

试验中铁皮石斛SOD采取热变性法[10]进行提取。采取1年生左右的铁皮石斛，去除叶，留其茎，洗净后用滤纸吸干水分，并将其直接粉碎，与水以2∶1的质量比进行匀浆，过滤之后60 ℃水浴20 min，用离心机以4 000 r/min离心20 min，取其上清液即得SOD粗品。

1.3.2 铁皮石斛SOD的纯化[11]

将硫酸铵结晶粉碎成白色粉末，缓慢定量加入SOD粗提物中，直至饱和至90%；放入冰箱30 min（4 ℃）；以4 ℃、4 000 r/min离心20 min，除去沉淀部分；向烧杯中加入硫酸铵粉末至其到达饱和度后，置于冰箱中30 min（4 ℃）；以4 ℃、4 000 r/min离心20 min，收集所得的沉淀。向沉淀中加入pH 7.8、5 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液（PB），并摇晃。

1.3.3 铁皮石斛SOD酶活性测定[12]

1.3.3.1 邻苯三酚自氧化速率测定[13]

取用试管，按照表1的试剂剂量加入pH 8.00的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液，将试管放置于25 ℃水温的水中保温10 min，加入50 mmol/L邻苯三酚，摇匀后倒入1 cm比色皿中。在320 nm波长下，4 min内，每30 s测1次吸光度。

表1 测定邻苯三酚自氧化速度加样表

1.3.3.2 SOD酶活性的测定[14]

按表2的剂量测定SOD酶活性，加入上述样品于样品管中，加入邻苯三酚。剩下步骤与1.3.3.1方法相同。根据吸光度，计算样品液体自动氧化率的变化，计算SOD酶活性。平行测定3份样品。活力单位定义在1 mL反应液中每分钟控制邻苯三酚自氧化速度达50%的酶量定义一个活力单位，即3.25 nm 0.030 A/min是1个动态的单位，如果氧化率在35%～65%，可以按比例计算，超出这个数值范围的试样应增加或减少样液量。

表2 测定SOD酶活性加样表 单位：mL

1.3.4 铁皮石斛SOD最适温度测定[15]

取上述提取的粗酶液20 ℃水浴10 min，根据邻苯三酚自动氧化体系，加邻苯三酚测定酶活，分别采用30，40，50，60和70 ℃重复上述操作，比较SOD酶活力大小。

1.3.5 铁皮石斛SOD在酸奶中应用

取100 mL纯牛奶，水浴加热至42 ℃后加入15 mL乳酸菌，发酵4 h后放在4 ℃冰箱中，后发酵12 h，SOD分别在后发酵前加入和在发酵前加入，测定2种情况在后发酵结束后的0，12和24 h的SOD酶活性。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛SOD的提取

在SOD的提取过程中，有热变性法和磷酸缓冲液2种方法，因为热变性法可以控制温度以及时间，对铁皮石斛SOD提取具有精确的条件，操作简单，成本低廉且无污染等优点，故试验中铁皮石斛SOD采取热变性的方法进行提取。提取的SOD酶活为8.72 U/mL。

2.2 铁皮石斛SOD的纯化[16]

用硫酸铵沉淀法对提取SOD粗酶液进行纯化，其酶活性显著提高。如图1所示。

由图1可见，纯化前SOD的酶活性为8.72 U/mL，纯化后活性提高到10.22 U/mL，经纯化后的酶活性有显著提高，考虑对后续试验提供更好帮助，提取后的酶均经硫酸铵分级纯化后进一步进行分析应用。

图1 SOD纯化前后酶活性

2.3 铁皮石斛SOD酶活性测定

用邻苯三酚自氧化法测定酶活，结果如图2所示。在碱性环境下邻苯三酚会被氧化，释放氧气并生成淡黄色中间产物，酶溶液的加入可抑制其自动氧化速率。结果表明，相对于一般材料，铁皮石斛SOD酶活性较高，有助于铁皮石斛在医药学等方面发展，满足抗衰老、调节机体等方面的需求，为后续SOD酶活性研究奠定基础。

图2 酶活曲线

2.4 铁皮石斛SOD最适温度测定

将上述试验所制备的样品进行不同温度的水浴，所得数据见图3。

通过图3分析试验中铁皮石斛SOD酶活性最适温度的测定结果，可以确定温度能影响铁皮石斛酶的活性。随着温度上升，在20～70 ℃时，酶活性不断升高，前期变化较快，中期变化较慢，直至70 ℃，SOD酶活性达到最佳，且不会造成变性失活。故铁皮石斛SOD酶活性最适反应温度为70 ℃。

图3 不同温度下SOD酶活性

2.5 铁皮石斛SOD在酸奶中的应用[17]

分别在牛奶发酵前、牛奶发酵后2种不同的发酵过程中添加SOD溶液，并在发酵结束后0，12和24 h检测其活性。数据见表3。

表3 酸奶中铁皮石斛SOD酶活性变化

结果表明：SOD在后发酵前添加，其酶活性高于在后发酵过程添加；经过12和24 h发酵并测定酶活性，均显示在发酵前加入会显著提高其活性，而发酵24 h后酶活性值出现更加明显的区别。在酸奶发酵前加入从铁皮石斛中提取纯化的SOD可使酸奶的活性上升，且在酸奶发酵前加入更有助于保持和提高酶活性。

3 讨论与结论

铁皮石斛自身具有极高的药用价值，国内外有关铁皮石斛活性成分含量探究较多，但有关于铁皮石斛中SOD的提取纯化及其应用的研究却很少。在试验过程中，将石斛提取出来，并进行纯化，测定酶活和其最适温度时，结果发现70 ℃时铁皮石斛的酶活最高。通过在酸奶中的应用可以发现，在发酵前加入铁皮石斛中提取的样品，其发挥的活性最高。此次试验以1年生铁皮石斛为原料进行SOD的提取及应用研究，为大别山产铁皮石斛价值的多样性以及铁皮石斛SOD资源的食品深开发利用提供重要参考依据和借鉴。