蒸馏法-气相色谱法联用测定葡萄酒中乙醛和糠醛

王焕琦，李红洲*，黄家岭，王正强

贵州省产品质量检验检测院（贵阳 550016）

葡萄酒在国内历史久远[1]，早在西汉时期我国就传入葡萄酒[2-3]，由此开启我国的葡萄酒业[4]，并在唐朝得到长足发展[5]，在宋朝时期陷入低迷[6]，在元朝更是因为当时政府的扶持到达鼎盛时期[7]，在我国历史上有关于葡萄酒相关的礼仪和诗歌也多有记载[8]，葡萄酒不仅味美，还有其独特的营养元素，如多种机酸和矿物质元素[9]葡萄酒不仅能够预防一些疾病还能够养颜美容，具有一定保健功能[10]。

醛类是葡萄酒中风味物质的重要组成部分，其中乙醛占据重要地位，低浓度的乙醛具有水果的愉快香味，一旦浓度升高则会产生辛辣气味[11]，然而在2009年乙醛被认为是强致癌物质[12]，糠醛别名2-呋喃甲醛是葡萄酒的一种重要呈香物质，是一种具有杏仁油的香气的无色液体，能更加突出葡萄酒空杯留香的特点[13]，可以说醛类物质是葡萄酒香气成分的重要组成部分，形成了葡萄酒协调柔和回味无穷的特点。

针对葡萄酒中乙醛含量的检测主要有：韦晓群等[14]采用2，4-二硝基苯肼（DNPH）柱前衍生气相色谱质谱法检测葡萄酒中乙醛，梁瑞娥等[15]采用顶空气相色谱法测定葡萄酒中微量甲醇、乙醛，王光冲[16]采用2，4二硝基苯肼（DNPH）柱前衍生结合HPLC测定葡萄酒中的总乙醛及游离乙醛。国内外针对葡萄酒中糠醛含量的检测极少主要文献有：李洋[17]等采用搅拌棒吸附萃取-气相色谱-质谱联用法测定葡萄酒中糠醛，李春光[18]等采用固相微萃取内标法结合气相色谱-质谱测定葡萄酒中糠醛。

结合查阅大量文献方法，总结针对葡萄酒中的乙醛的检测多采用柱前衍生法，即前处理采用2，4二硝基苯肼（DNPH）柱前衍生后通过气相色谱-质谱法测定或者通过HPLC液相色谱法测定，存在前处理复杂繁琐、仪器设备昂贵、试验成本过高的问题，而固相微萃取技术前处理法存在商用萃取成本过高的问题，针对同时检测葡萄酒中乙醛和糠醛的文献较少。因此，试验通过查看相关文献并结合日常检验检测工作，建立蒸馏法-气相色谱法联用测定葡萄酒中乙醛和糠醛的方法，该方法简单稳定高效，能够除去葡萄酒中糖和色素等干扰因素对气相色谱仪的干扰并且大幅降低检验检测成本，以期更好解决葡萄酒醛类物质测定前处理复杂、试验成本过高的问题。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙醛标准品；糠醛标准品；乙酸正戊酯标准品（作内标用）；4-甲基2-戊醇溶液（作内标用）；乙醇（色谱纯）；市售葡萄酒；超纯水，GB/T 6682—2008规定的一级水Milli-Q academic超纯水系统制备。

1.2 仪器与设备

高效气相色谱仪配有氢火焰离子化检测器（1260II，美国安捷伦公司）；检测器（氢火焰离子化FID）；全玻璃蒸馏器（500 mL）；恒温水浴（温控±0.1 ℃）。

1.3 试验方法

1.3.1 模拟酒样、标准储备溶液和使用溶液的配制

1.3.1.1 模拟酒样

模拟葡萄酒12%的酒度，取无水乙醇12 mL用超纯水定容100 mL，使无水乙醇的体积分数为12%。

1.3.1.2 内标溶液

乙酸正戊酯溶液（2%）：作乙醛内标使用。吸取乙酸正戊酯标准品2 mL，使用12%无水乙醇溶液定容至100 mL。

4-甲基2-戊醇溶液（2%）：作糠醛内标使用。吸取4-甲基2-戊醇标准品2 mL，使用12%无水乙醇溶液定容至100 mL。

1.3.1.3 标准储备溶液

准确称取10 mg乙醛和糠醛标准品，使用12%无水乙醇溶液定容至100 mL分别得到1 000 μg/mL标准储备溶液。

1.3.1.4 标准使用溶液

分别吸取适量乙醛和糠醛标准储备溶液适量于10 mL容量瓶中使用12%无水乙醇溶液定容至10 mL，分别加入乙酸正戊酯溶液（2%）和4-甲基2-戊醇溶液（2%）内标物质各0.1 mL，分别得到一系列质量浓度为5.0，15.0，25.0，50.0，70.0和100.0 μg/mL乙醛标准使用液和一系列质量浓度为0.5，1.0，5.0，10.0，20.0和50.0 μg/mL糠醛标准使用液。

1.3.2 样品处理过程

用一干燥、洁净100 mL容量瓶，准确量取100 mL酒样（液温20 ℃）与500 mL蒸馏瓶中，用50 mL超纯水分3次冲洗容量瓶，洗液一并入蒸馏瓶，加入几颗沸石，连接冷凝管，以取样用的原容量瓶作为接收器（外加冰浴），开启冷却水（冷却水温度最好低于15 ℃），缓慢加热蒸馏，收集馏出液，容量瓶中液体接近刻度时，取下容量瓶，盖塞，在20 ℃水浴中保温30 min，在补加水至刻度，混匀，备用。

取酒样馏出液10 mL于10 mL容量瓶中定容，分别加入乙酸正戊酯溶液（2%）和4-甲基2-戊醇溶液（2%）内标物质各0.1 mL，混匀后过0.22 μm滤膜，待测。

1.3.3 气相色谱条件

色谱柱，ZKAT-LZP930.2毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm，中国，中科安泰公司）。柱温控制程序：初始温度50 ℃，保持5 min后，以5 ℃/min升温至90 ℃，以15 ℃/min升温至200 ℃；保持2 min进样口温度200 ℃；检测器温度200 ℃；载气为高纯氮气（纯度＞99.999%），流量1 mL/min；氢气流量30 mL/min；空气流量400 mL/min；尾吹气流量25 mL/min；分流比5∶1；进样量1.0 μL。

1.3.4 标准曲线绘制

取1.3.1中一系列标准使用液在1.3.3气相色谱条件下检测，以峰面积值（y）对应进样质量浓度（x）进行线性回归，加入内标以内标法定量。

1.3.5 重复性试验

分别取适量的乙醛和糠醛标准储备液，使用无水乙醇溶液（体积分数12%），分别配制成质量浓度30 μg/mL标准溶液，2种标准溶液在1.3.3气相色谱条件下检测进样6针，计算相对标准偏差，并且考察测定值的一致性。

1.3.6 加标回收试验

分别取50 mL酒样于3个100 mL容量瓶分别加入0.5，1和5 mL乙醛标准储备液，以及50，100和500 μL糠醛标准储备液，取适量酒样定容100 mL，按照1.3.2和1.3.3方法进行加标回收试验，并且做样品空白检验，减去其本底值进而计算相对标准偏差SRSD和平均回收率（n=5）。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的优化

通过大量文献资料的查阅，色谱柱的选择主要有DB-5MS毛细管柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）、DB-WAX毛细管柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）、CP WAX 57 CB毛细管柱（50.0 m×0.25 mm×0.25 μm）。通过试验表明，色谱柱选择DB-5MS毛细管柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）时目标物质虽然可以实现分离但是乙醛物质目标峰型较宽，并且有一定的拖尾，降低检测灵敏度，色谱柱选择DB-WAX毛细管柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm），色谱图峰型较好，但是在测定样品时糠醛物质目标峰会和干扰物质部分重合，并且进口色谱柱采购成本过高，试验以降低试验成本和增大分离效果增强检测灵敏度的原则，确定使用ZKAT-LZP930.2毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm，中国，中科安泰公司）国产色谱柱，不断优化条件，确定最佳色谱条件：柱温控制程序为，初始温度50 ℃，保持5 min后，以5 ℃/min升温至90 ℃，以15 ℃/min升温至200 ℃；保持2 min进样口温度200 ℃；检测器温度200 ℃；载气为高纯氮气（纯度＞99.999%），流量1 mL/min；氢气流量30 mL/min；空气流量400 mL/min；尾吹气流量25 mL/min；分流比5∶1；进样量1.0 μL。从图1和图2可知，在最佳色谱条件下，各标准物质都有较好的分离度，并且峰型较好。

图1 标准溶液中2种标准物质和2种内标的色谱图

图2 样品中2种标准物质和2种内标的色谱图

2.2 葡萄酒样前处理方法讨论

2.2.1 纯水添加量的优化

在蒸酒过程中纯水添加太少会导致蒸酒时间过短导致标准物质挥发不充分，而纯水添加过多会导致蒸酒时间过长，导致试验时间过长，试验考察在加标样品中纯水添加量（20，30，40，50，60和70 mL），每一种添加量平行测定3次取平均回收率考察乙醛和糠醛加标样品平均回收率的的影响，结果如图3所示。试验结果表明，纯水添加量50 mL时，乙醛和糠醛回收率达到最高而后随着纯水添加量的提高回收率基本保持不变，为确保乙醛和糠醛有较好的回收率和节约试验时间的目的，最终确定最优纯水添加量为50 mL。

图3 纯水添加量对乙醛和糠醛回收率的影响

2.3 线性关系，线性范围

从表1可以看出，乙醛和糠醛的线性范围分别是5.0～100.0 μg/mL和0.5～50.0 μg/mL，相关性系数为0.999 33和0.999 75，相关系数R2＞0.999，以信噪比3（S/N=3）确定检出限（limit it of detection，SLOD）。

表1 葡萄酒中乙醛及糠醛的线性回归方程，相关系数及检出限

2.4 精密度与回收率

试验在方法测定低限，2倍方法测定低限和10倍方法检测低限进行3个水平试验（n=5），每个水平分别计算平均回收率，结果见表2。该方法检测葡萄酒中乙醛及糠醛测定低限加标的相对标准偏差（SRSD）为1.47%～4.23%，平均回收率为82.47%～89.66%，2倍方法测定低限的相对标准偏差（SRSD）为1.66%～ 5.33%，平均回收率为89.44%～92.15%，10倍方法检测低限的相对标准偏差（SRSD）为1.54%～4.52%，平均回收率为93.14%～95.26%，说明该检验方法对葡萄酒中乙醛和糠醛的检测有良好的精密度和准确性，满足检验分析要求。

表2 葡萄酒中乙醛及糠醛相对标准偏差与加标回收率（n=5）

2.5 重复性

经过测定葡萄酒中乙醛和糠醛检测值的SRSD分别为1.55%和1.80%，结果见表3，可以看出2种标准物质SRSD＜5%，表明葡萄酒中乙醛和糠醛在最佳色谱仪器条件下有良好重复性。

表3 方法重复性测定

2.6 样品中乙醛和糠醛含量的测定

从表4可知，5种市售葡萄酒中乙醛均有检出，但是含量差异有变化，其中河北干红葡萄酒乙醛和糠醛含量最高，分别为65.24和5.78 μg/mL，而贵州蓝莓酒乙醛和糠醛含量最低，分别为10.22 μg/mL，未检出。

表4 实际样品检测

3 结论

试验建立蒸馏法-气相色谱法联用同时配合内标法测定葡萄酒中乙醛和糠醛含量的检测方法，采用蒸馏法除去葡萄酒中糖和色素等干扰物质对气相色谱的影响，简化以往衍生化法和固相微萃取法试验步骤和试验成本，并且优化蒸馏法中纯水添加量，确定纯水添加量为50 mL，节省了试验时间，同时优化了气相色谱柱和色谱条件，确定色谱条件为：ZKAT-LZP930.2毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm，中国，中科安泰公司），柱温控制程序：初始温度50 ℃，保持5 min 后，以5 ℃/min升温至90 ℃，以15 ℃/min 升温至200 ℃；保持2 min进样口温度200 ℃；检测器温度200 ℃；载气为高纯氮气（纯度＞99.999%），流量1 mL/min；氢气流量30 mL/min；空气流量400 mL/min；尾吹气流量25 mL/min；分流比5∶1；进样量1.0 μL。结果表明，乙醛和糠醛分别在5.0～100.0 μg/mL和0.5～50.0 μg/mL线性关系良好，相关系数R2分别为0.999 33和0.999 75，乙醛和糠醛重复性检测值SRSD值为1.55%～1.80%，3个水平样品加标平均回收率分别为82.47%～89.66%，89.44%～92.15%和93.14%～95.26%，方法精密度（SRSD）分别为1.47%～4.23%，1.66%～5.33%和1.54%～4.52%（n=5），乙醛和糠醛的方法最低检出限分别为4.48和0.54 μg/mL，说明试验方法重现性，精密度和准确性良好，测得5种市售葡萄酒乙醛含量范围为10.22～65.24 μg/mL，糠醛含量范围为1.51～5.78 μg/mL，该方法简便，准确，减少了前处理步骤，使用更加便宜的检测设备，降低了试验成本，为葡萄酒中乙醛和糠醛的检测提供新方法。