气相色谱三重四极杆质谱测定食品中丙烯酰胺

王川丕，孙文闪*，周敏，刘芯成，钟寒辉，董叶箐

绿城农科检测技术有限公司（杭州 310051）

2002年瑞典国家食品管理局（Swedish National Food Administration）和斯德哥尔摩大学（Srockholm University）首次报告油炸或焙烤富含淀粉的食品中含有大量丙烯酰胺，德国、瑞典、比利时、中国、日本、美国、英国等的研究人员也发表了类似报道，丙烯酰胺对高温加热食品的污染引起国际组织和各国政府的高度关注。进一步研究发现丙烯酰胺主要是食物在加热处理时（大于100 ℃）其天冬酰胺和还原糖通过美拉德反应而生成，并且随着加热时间延长而增加[1]。世界卫生组织（WHO）和联合国粮农组织（FAO）联合协商报告中指出丙烯酰胺具有潜在的神经毒性、生殖发育毒性、遗传毒性和致癌性[2-4]。因此，建立一种简单快速灵敏的测定食品中丙烯酰胺的测定方法非常重要。

丙烯酰胺的测定方法主要有液质联用法[5-8]、液相色谱法[9-12]、气相色谱法[11-13]、气质联用法[14-18]。液相色谱法灵敏度低且容易受杂质干扰，需要较高的浓缩倍数和复杂的净化过程，操作复杂。液质联用法虽然具有较高的灵敏度，食品基质的复杂性需要前处理进行反复的净化，操作繁琐。气相色谱法、气质联用法需要用到溴试剂衍生问题对试验操作造成较大困扰。试验建立一种使用溴化钾、溴酸钾和硫酸代替溴试剂的衍生方法，衍生后采用吹扫捕集富集后直接进样，三重四级杆MRM模式测定，同位素内标消除基质效应从而为食品中丙烯酰胺的测定提供一个简单、高灵敏、准确的分析方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

GC-2010 plus气相色谱仪、TQ8040质谱仪（日本岛津公司）；TELEDYNE Tekmar Atomx吹扫捕集仪（美国Tekmar公司）；ST16R高速离心机（美国赛默飞世尔公司）；硫酸（优级纯，国药集团）；溴化钾、溴酸钾、硫代硫酸钠（分析纯，北京化工厂）；标准品丙烯酰胺、13C3-丙烯酰胺（纯度＞99%，德国Dr Ehrenstofer公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

1.2.1.1 提取

称取1 g±0.001 g样品（精确到0.001 g）于50 mL聚丙烯离心管中，加入10.0 mg/L13C3-丙烯酰胺内标溶液10.0 μL，加入20.0 mL超纯水，以2 500 r/min涡旋混合3 min，超声提取20 min，以8 000 r/min离心5 min，上清液待衍生。

1.2.1.2 衍生

取上述上清液2.00 mL至15 mL离心管，依次加入0.10 mL 10%硫酸溶液，1.0 mL 4.00 mol/L溴化钾溶液，0.50 mL 0.10 mol/L溴酸钾溶液，涡旋混匀，于4 ℃条件衍生45 min后，加入0.80 mL 0.20 mol/L硫代硫酸钠溶液终止衍生反应，涡旋振荡至溶液变为无色，将全部衍生液转移到40 mL吹扫捕集瓶内，用纯水定容到刻度混匀，待测定。

1.2.2 吹扫捕集条件

吹扫温度50 ℃；吹扫流速40 mL/min；吹扫时间10 min；脱附温度220 ℃；脱附流量300 mL/min；烘烤温度280 ℃。

1.2.3 色谱条件

DB-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气，高纯氦气；碰撞气，高纯氩气，纯度≥ 99.999%；柱流量1.0 mL/min。色谱柱程序温度：65 ℃保持1 min，以15 ℃/min升至200 ℃，以40 ℃/min的速度升至240 ℃，并保持5 min。

1.2.4 质谱条件

色谱-质谱接口温度250 ℃；电离方式，EI；离子源温度250 ℃；检测器电压0.99 kV；测定方式，多重反应监测模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；扫描时间5～10 min；定性、定量离子对、碰撞能量等参数见表1，其中*为定量离子对。

表1 丙烯酰胺及其内标质谱检测参数

1.2.5 标准溶液配制

标准溶液配制参考文献[16]，用中间溶液配制丙烯酰胺标准曲线质量浓度分别为0.050，0.200，1.00，5.00，20.0和50.0 μg/L，内标质量浓度1.00 μg/L，现用现配，分别取2.00 mL进行衍生，衍生过程同1.2.1。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

在（EI）源模式下对丙烯酰胺及其内标衍生物进行一级质谱扫描，找到母离子，对母离子进行二级扫描，根据二级扫描质谱图，选择强度最大的2个子离子，设定3～45 eV进行碰撞能量优化，优化后响应最强的离子对作为定量离子对，响应次之的为定性离子对。图1为优化后的气相色谱质谱条件采集的丙烯酰胺及其内标衍生物总离子色谱图。

图1 丙烯酰胺及其内标衍生物MRM总离子色谱图

2.2 吹扫捕集条件的优化

2.2.1 吹扫温度的优化

吹扫的温度对目标物的富集具有重要的作用，比较吹扫温度25～70 ℃时，50.0 μg/L丙烯酰胺衍生物的峰面积，结果见图2。随着吹扫温度升高，丙烯酰胺衍生物峰面积增加，达到50 ℃时，丙烯酰胺衍生物的峰面积达到稳定，因此，确定吹扫温度为50 ℃。

图2 吹扫温度对衍生产物峰面积的影响

2.2.2 脱附温度的优化

脱附温度同样会影响目标物的峰面积，比较脱附温度170～260 ℃对丙烯酰胺衍生物（50.0 μg/L）的峰面积影响，结果见图3，丙烯酰胺衍生物的峰面积随着脱附温度增加而增大，脱附温度220 ℃时，峰面积最大，超过220 ℃时，峰面积下降，可能原因为丙烯酰胺衍生物2，3-二溴丙烯酰胺在高温条件下分解[14]，因此，吹扫捕集的脱附温度定为220 ℃。

图3 脱附温度对衍生产物峰面积的影响

2.2.3 硫酸溶液使用量的优化

硫酸溶液的作用是为衍生反应提供合适的pH条件，使衍生反应达到最佳效果，其他保持不变的条件下，比较了添加0.06～0.14 mL 10%硫酸溶液对丙烯酰胺衍生物（50.0 μg/L）峰面积的影响，结果见图4。10%硫酸溶液体积0.1 mL时，对衍生反应最有利，因此确定硫酸溶液的使用量为0.10 mL。

图4 硫酸溶液用量对衍生产物峰面积的影响

2.2.4 溴化钾溶液使用量的优化

溴化钾溶液主要作为反应的还原剂，作为溴单质生成的来源之一，保持其他不变的条件下，比较了添加0.4～1.4 mL 4.0 mol/L溴化钾溶液对丙烯酰胺衍生物（50.0 μg/L）峰面积的影响，结果见图5。4.0 mol/L溴化钾溶液体积1.0 mL时，衍生反应产物峰面积达到最大，因此，确定溴化钾溶液的使用量为1.0 mL。

图5 溴化钾溶液用量对衍生产物峰面积的影响

2.2.5 溴酸钾溶液使用量的优化

溴酸钾溶液主要作为反应的氧化剂，也是溴单质生成的来源之一，其他保持不变的条件下，比较了添加0.2～0.7 mL 0.2 mol/L溴酸钾溶液对丙烯酰胺衍生物（50 μg/L）峰面积的影响，结果见图6。溴酸钾溶液0.5 mL时，衍生反应产物峰面积达到最大值，因此确定溴酸钾溶液体积为0.5 mL。

图6 溴酸钾用量对衍生产物峰面积的影响

2.2.6 衍生反应时间的优化

衍生反应时间对衍生效果有一定影响，衍生试剂量确定后，比较4 ℃条件下，反应时间20～65 min对丙烯酰胺衍生物峰面积的影响，结果见图7。衍生反应时间45 min时，衍生反应产物（50.0 μg/L）峰面积达到稳定，因此，衍生反应时间为45 min。

图7 反应时间对衍生产物峰面积的影响

2.3 方法的检出限、定量限、线性范围

检出限（LOD）和定量下限（LOQ）的确定通过样品加标回收，进样分析为3倍信噪比和10倍信噪比，得到分别为0.300和1.00 μg/kg。在1.2.2，1.2.3和1.2.4仪器条件下进样分析，丙烯酰胺的衍生产物在1.00～1.00×103μg/kg范围内的有好的线性关系，线性方程为y=1.36x-0.212，相关系数R2=0.999。

2.4 方法的准确度与精密度

方法的准确度通过回收率来考察，精密度通过同一浓度平行添加6次回收率的相对标准偏差（SRSD）获得，添加质量分数分别为定量限1.00 μg/kg，10倍定量限10.0 μg/kg，线性范围最高点对应的样品浓度1.00×103μg/kg。加标样品选择为饼干、薯条、油炸方便面、面包四种常见油炸或焙烤富含淀粉的食品，回收率和相对标准偏差（SRSD）的结果见表2。丙烯酰胺在四种基质中的回收率（79.2%～92.6%）和精密度（5.17%～9.15%）符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范基本信息 食品理化检测》的要求。

表2 回收率和精密度试验结果

2.5 实际样品分析

运用该方法对超市随机购买上的饼干、油炸方便面、油炸薯条、面包等食品进行测定，发现丙烯酰胺的检出率为100%，质量分数在1.50～723 μg/kg。因此食品生产企业在生产过程需要进一步提高技术，控制好温度和时间，尽可能减少丙烯酰胺的产生，消费者尽量减少食用油炸和烘焙高淀粉类食品。

3 结论

试验建立一种使用溴化钾、溴酸钾和硫酸代替溴试剂的衍生方法，衍生后采用吹扫捕集富集后直接进样，气相色谱-三重四级杆质谱联用测定食品中丙烯酰胺，同位素内标法定量。该方法前处理简单，有机试剂消耗量少，灵敏度高，结果准确，为食品中丙烯酰胺的测定提供有效的分析方法。