侗药马卡列丙总皂苷的提取工艺研究*

罗贞贵，李 星，曾雅静，许培增，周伟道，何 硕，刘 冰

(湖南医药学院药学院，湖南 怀化 418000)

马卡列丙Duhaldeanervosa(WallichexCandolle)A．Anderberg为菊科羊耳菊属显脉旋覆花的全草，广泛分布于中国湖南、贵州、云南、广西等地，是一种多民族的民间常用药材[1-2]。马卡列丙在云南、贵州等地是苗族常用药，俗称“小黑药”、“草威灵”等，根供药用，有滋补功效。《云南中草药选》记载，此药祛风湿，通经络，消积止痛，治风湿性关节炎、腰腿痛、胃痛、消化不良、骨鲠喉；《贵州民间药物》中，该药补气血，止汗。湖南通道地区马卡列丙又称毛秀才，是侗乡从古到今常用的跌打损伤特效单方良药，常用于跌打损伤，伤目出血，骨折，肚痛[3-4]。

马卡列丙中已报道的主要化学成分为挥发油类、黄酮类、苯丙素类、三萜和甾体类等成分[5-7]。谭紫玲等[8]已对马卡列丙的化学成分进行了预实验，初步确定马卡列丙含有皂苷类化学成分，但有关马卡列丙总皂苷的研究尚未见报道。已有研究报道，皂苷类成分具有广泛的生理活性，如抗炎、抗肿瘤、抗氧化、调节免疫等。如重楼皂苷可通过线粒体途径近而实现诱导肿瘤细胞凋亡[9]。研究发现人参皂苷也可通过血脑屏障作用于中枢神经系统，有效的治疗阿尔茨海默等疾病[10]。因此本对马卡列丙总皂苷的提取工艺进行研究，对阐明侗药马卡列丙有效成分、对下一步进行活性研究、从而寻找新药源具有重要意义。

1 实验材料与仪器

1.1 药 材

马卡列丙Duhaldeanervosa干燥根和茎于 2018 年12 月购于云南，经湖南医药学院侗医药研究湖南省重点实验室生药学专家汪冶教授鉴定为菊科显脉旋覆花，根(编号为 2018120401)标本存于药学院。

1.2 试 剂

人参皂苷Re标准品(含量≥98.0%，批号B04D9S76499)，上海源叶生物科技有限公司、甲醇、石油醚(分析纯)，天津市富宇精细化工有限公司；95%乙醇、高氯酸、硫酸，成都金山化学试剂有限公司；香草醛(分析纯)，天津市科密欧化学试剂开发中心；实验用水均为超纯水。

1.3 仪 器

AUW120D型电子分析天平，日本岛津有限公司；MY-50分级连续投料粉碎机，广州市扬鹰医疗仪器有限公司；DZKW-S-8电热恒温水浴锅，北京市光明医疗仪器有限公司；L53R医用离心机，长沙高新技术产业开发区湘仪离心机有限公司；UV752N紫外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；Mighty-10超纯水机，上海砾鼎水处理设备有限公司。

2 实验方法

2.1 含量测定

2.1.1 马卡列丙总皂苷制备流程

取经粉碎的马卡列丙粉末(过60目筛)，加3倍粉末体积的石油醚索式提取脱脂，滤渣40 ℃减压干燥。取脱脂后的马卡列丙粉末，加水100 ℃回流提取1.0 h，多次离心，直至上清液无色，合并上清液，减压浓缩至干燥，即得马卡列丙总皂苷粗品。

2.1.2 标准曲线绘制

标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液20 μL、40 μL、 80 μL、120 μL、160 μL、200 μL,分别置于具塞试管中,低温挥去溶剂,加人1%香草醛高氯酸试液0. 5 mL,置60 ℃恒温水浴上充分混匀后加热15 min,立即用冰水冷却2分钟,加入77%硫酸溶液5 mL,摇匀;以相应试剂作空白,照紫外-可见分光光度法(通则0401),在540nm波长处测定吸光度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标绘制标准曲线[11]。得回归方程为 A= 0.0266C-0.03，R2= 0.9996。表明该化合物在 20～ 120 μg范围内存在很好的线性关系。

2.2 单因素试验

取1.00 g 马卡列丙粉多份，其他因素不变的情况下，按“2.1”项下方法实验，分别考察提取溶剂、料液比、提取温度、提取时间以及提取次数对马卡列丙总皂苷得率的影响，以总皂苷提取率为指标进行单因素试验。

2.3 正交试验

根据单因素试验结果，选取对试验影响较大的因素通过 L9(34)正交表进行试验。

3 结果与讨论

3.1 单因素实验结果

3.1.1 溶剂的选择

固定料液比1:20，提取时间1 h，提取温度 60 ℃，考察水和不同浓度的乙醇对马卡列丙总皂苷得率的影响。结果见图1。结果表明，乙醇体积分数越小，总皂苷得率越高，水的提取效率高于乙醇溶液，随着乙醇浓度增加时，马卡列丙总皂苷得率呈下降趋势。可能原因是随着乙醇浓度增加，导致蛋白质等物质变性，吸附皂苷，不利于其溶出，得率下降[12]。故用水代替乙醇溶液继续试验。

图1 乙醇浓度对总皂苷得率的影响

3.1.2 料液比

固定提取时间1 h，提取温度60 ℃，考察料液比1:10、 1:15、1:20、1:25、1:30对马卡列丙总皂苷得率的影响。结果见图2。在料液比1:20时，马卡列丙总皂苷得率值最大，随后料液比继续降低时，总皂苷得率呈下降趋势。可能是由于溶液量的增加，加大了其与原料的接触面积及液体传质推动力，利于皂苷的溶出，在料液比一定时，得率最高；之后溶液量的继续增加，会使原料吸附皂苷使其不易溶出[13]，得率下降。

图2 料液比对总皂苷得率的影响

3.1.3 提取温度

固定提取时间 1 h，料液比 1:20，考察提取温度60，70，80，90，100 ℃对马卡列丙总皂苷得率的影响。结果见图3。在提取温度100 ℃时，马卡列丙总皂苷得率最大。说明温度的升高能促进马卡列丙总皂苷的提取[14]。

图3 提取温度对总皂苷得率的影响

3.1.4 提取时间

固定料液比1:20(g·mL-1)，提取温度 100 ℃，考察提取时间 1，1.5，2，2.5，3 h对马卡列丙总皂苷得率的影响。结果见图 4。结果显示，1 h 时，马卡列丙总皂苷得率最大，当时间继续延长时，总皂苷得率呈下降趋势。在提取时间较短时，可能皂苷与多糖、蛋白质等物质结合不易溶出；随时间的延长，原料中的皂苷大量快速溶出，溶液趋于饱和，同时长时间高温会导致皂苷降解，使其得率下降[15]。

图4 提取时间对总皂苷得率的影响

3.1.5 提取次数

固定提取时间1 h，提取温度60 ℃，料液比1:20(g·mL-1)，考察提取次数1、2、3、4次对马卡列丙总皂苷得率的影响。结果见图 5。结果显示，随着提取次数增加，马卡列丙总皂苷得率呈现增加的趋势，但幅度较小。为节省时间和减少溶剂用量，故之后的实验选择提取次数为1次。

图5 提取次数对总皂苷得率的影响

3.2 正交试验设计

将马卡列丙加热回流的工艺路线，通过L9(34)正交表进行试验设计，以马卡列丙总皂苷得率为醇提评价指标，提取温度(A)、料液比(B)、提取时间(C)为影响因素进行优化，因素水平表见表1。

表1 马卡列丙提取工艺因素水平表

3.3 正交试验结果

称取马卡列丙药材9份，每份1.00 g，按L9(34)正交表的条件提取，提取溶剂为水，提取1次，多次离心至上清液无色透明，合并上清液，定容至250 mL，备用。共得到9份提取液，按“2.1”项下方法测定马卡列丙总皂苷含量。结果见表2，方差分析见表3。

表2 马卡列丙总皂苷提取L9(34)正交试验及结果

表3 马卡列丙提取工艺正交试验方差分析表

由表2和表3可见，以总皂苷含量为指标，马卡列丙的正交提取实验中考察因素的影响大小依次为：A提取温度>C液料比>B提取时间，且A因素具有显著性差异(P<0.05)。A因素中A3>A2>A1，故选择A3；B因素中B3>B1>B2，故选B3；C因素中，C2>C3>C1，故选C2，由此可推出，A3B3C2为最优方案，即提取温度100 ℃，料液比1:25，提取时间 1.0 h。

3.4 最佳工艺验证试验

称取马卡列丙药材3份，每份10.00 g，按照以上结果分析的最佳工艺提取，即提取温度100 ℃，料液比1:25，提取时间 1.0 h，测定总皂苷含量，结果见表4。

表4 马卡列丙提取工艺验证试验结果

通过表4可以看到最佳的工艺条件下所得到的总皂苷含量处于较高水平，且RSD值很小，说明本提取工艺合理、可靠。

4 结 论

通过查阅文献，谭紫玲等[8]已对马卡列丙的化学成分进行了预实验，初步确定马卡列丙含有皂苷类化学成分，但有关马卡列丙总皂苷的研究尚未见报道。因此，通过单因素和正交试验，确定最佳的提取工艺，为马卡列丙总皂苷的开发利用奠定基础。

在单因素试验中，考察水和不同浓度乙醇对马卡列丙总皂苷得率的影响，随着乙醇浓度增加时，马卡列丙总皂苷得率呈下降趋势，故选择水为提取溶剂。提取次数相比较料液比、提取时间、提取温度这3个因素时，不是马卡列丙总皂苷提取的主要因素，为了节省时间和减少溶剂用量，故提取次数选择为1次。综合以上单因素试验和正交试验结果，确定马卡列丙总皂苷的最佳工艺：提取溶剂为水，料液比1:25，提取温度100 ℃，提取时间 1.0 h，提取1次，总皂苷提取率可达 6.40%。