炮制前后王不留行中3种黄酮苷在大鼠体内药动学的变化

于现阔， 吴宏伟， 罗寒燕， 张 晓， 鲁亚奇， 唐力英， 王祝举

(中国中医科学院中药研究所，北京 100700)

王不留行始载于《神农本草经》，来源于石竹科植物麦蓝菜VaccariasegetalisCarcke的干燥成熟种子[1]，其外观呈黑色圆球状，质硬，难破碎，临床应用时要求“炒制”，现行《中国药典》及地方炮制规范均要求炒至大部分爆花。炒王不留行最早见于《外科正宗》[2]，沿用至今，并成为唯一炮制方法。传统炮制理论认为，王不留行生品长于消痈肿，炒后性偏走散，长于活血通经、下乳、利尿通淋[3]，主要含有三萜皂苷、黄酮以及环肽[4]。

Qi等[5-6]灌胃给予大鼠王不留行提取物后发现，在血浆中能检测到黄酮及三萜皂苷。王不留行黄酮苷[7]是最主要的特征性黄酮，具有保护过氧化氢诱导血管内皮细胞损伤[8]、抑制高糖引起血管内皮细胞凋亡[9]及钛引起骨质溶解[10]等药理作用。王不留行炒制后，可提高其水浸出物及总黄酮含量[11-12]，升高黄酮类、刺桐碱、环肽等成分的水煎出率[13-14]，其原理可能是通过增加有效成分的溶出以增强疗效，但仅从含量变化上分析[15-16]尚不充分。因此，本实验在前期成分分离及分析的基础上，建立UPLC-MS/MS法比较炮制前后王不留行主要成分药动学变化，探索其在大鼠体内的吸收代谢规律，以期为阐释该药材炮制原理提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 LC-20AXR高效液相色谱仪(日本 Shimadzu公司)；串联三重四极杆质谱仪Qtrap5500、Analyst 1.6.2质谱数据采集软件(美国 AB Sciex公司)；Minispin离心机、真空离心浓缩仪、Mikro 220R台式高速冷冻离心机、移液枪(德国 Eppendorf 公司)；Mix 3000振荡混匀仪(杭州米欧仪器有限公司)；XS105DU电子分析天平(十万分之一，瑞士Mettler-Toledo公司)。

1.2 试剂与药物 王不留行(批号HBAG2014)收集于河北省安国市药材市场，经中国中医科学院中药所王祝举研究员鉴定为麦蓝菜VaccariasegetalisCarcke的干燥成熟种子。按照2020年版《中国药典》一部清炒法(通则0213)制备炮制品[1]，具体方法为取生品200 g，待锅底温度升至270 ℃后倒入锅中，炒至大多数爆花，炒制时间约为2 min。王不留行黄酮苷、肥皂草苷、异牡荆素-2″-O-阿拉伯糖苷为本实验室分离，结构经核磁波谱鉴定，HPLC法检测纯度均大于98%；内标蒙花苷(批号AF7031520)购于成都埃法生物科技有限公司，纯度大于98%。乙腈、甲醇、甲酸(美国Fisher 公司)均为色谱纯；水为娃哈哈纯净水。

1.3 动物 雄性SD大鼠12只(SPF级)，体质量为240～260 g，由斯贝福(北京)生物科技有限公司提供，动物生产许可证号SCXK(京)2016-0002。大鼠在标准环境下[温度(23±1)℃，相对湿度(55±5)%]适应性喂养3 d，给药前12 h 禁食，自由饮水。动物实验均符合中国中医科学院中药研究所伦理委员会相关规定。

2 方法与结果

2.1 提取物制备 取生品、炮制品粉末(过3号筛)各100 g，置于圆底烧瓶中，加入70%甲醇1 000 mL，加热回流1 h后提取2次，滤过，合并滤液，减压回收溶剂，浸膏加适量水溶解定容至40 mL，生药量2.5 g/mL，冷藏保存。HPLC法[5]测得生品中王不留行黄酮苷、肥皂草苷、异牡荆素-2″-O-阿拉伯糖苷含量分别为0.41%、0.02%、0.03%，而炮制品中分别为0.36%、0.02%、0.07%。

2.2 对照品、内标溶液及质量控制(QC)样品制备 精密称取王不留行黄酮苷、肥皂草苷、异牡荆素-2″-O-阿拉伯糖苷对照品适量，甲醇溶解定容，再按一定倍数稀释，即得不同质量浓度的对照品溶液。精密称取内标(蒙花苷)适量，甲醇溶解定容，即得内标溶液(1 mg/L)。取低、中、高质量浓度对照品溶液，真空浓缩，挥干溶剂，加入适量空白血浆混匀，即得QC样品，在-20 ℃下冷冻保存。

2.3 分析条件

2.3.1 色谱 Waters ACQUITY HSS T3色谱柱 (2.1 mm×100 mm, 1.8 μm)；流动相乙腈(A)-水(含0.1%甲酸)(B)，梯度洗脱(0～1 min, 0～10%A; 1～2 min, 10%～20%A; 2～10 min, 20%～30%A; 10～10.5 min, 30%～80%A; 10.5～11 min, 80%～100%A; 11～11.1 min, 100%～10%A; 11.1～13 min, 10%A)；体积流量0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量5 μL。

2.3.2 质谱 电喷雾离子源(ESI)；喷雾电压5 500 V；雾化温度 580 ℃；气帘气30 psi(1 psi=0.133 kPa)；雾化气55 psi，辅助气60 psi；正离子模式检测，多反应监测(MRM)；王不留行黄酮苷m/z727.2～313.1(45 V)，异牡荆素-2″-O-阿拉伯糖苷m/z565.1～283.1(46 V)，肥皂草苷m/z595.1～415.1(25 V)，内标m/z593.2～447.1(25 V)。

2.4 给药及采血 12只大鼠随机分为生品组、炮制品组，每组6只，给药前禁食12 h不禁水，灌胃给予王不留行提取物(0.01 mL/g)，于给药前及给药后5、10、20、30、45 min及1、2、4、8、12、24 h眼底静脉丛取血各0.3 mL，置于1.5 mL肝素钠EP管中，3 000 r/min离心10 min，取上层血浆，在 -20 ℃下冷冻保存。

2.5 样品处理 取“2.4”项下血浆样品100 μL，置于1.5 mL离心管中，加入5 μL内标溶液(2.51 mg/L)、甲醇300 μL，涡旋振摇10 min，混匀，13 200 r/min冷冻离心10 min，取上清液100 μL，置于250 μL内插管的样品瓶中，进样5 μL分析。

2.6 方法学考察

2.6.1 专属性考察 取空白血浆6份，每份100 μL，按“2.5”项下方法处理，其中内标用等体积甲醇代替，在“2.3”项条件下进样测定，另取中质量浓度QC样品及给药后20 min样品，同法处理，结果见图1。由此可知，王不留行黄酮苷、异牡荆素-2″-O-阿拉伯糖苷、肥皂草苷、内标保留时间分别为4.19、4.84、4.36、10.35 min，各黄酮苷峰形较好，出峰时间无干扰，也无血浆内源性物质等其他成分的影响。

2.6.2 线性关系考察 取“2.2”项下对照品溶液100 μL，置于1.5 mL离心管中，真空离心，挥干溶剂，加入100 μL空白血浆混匀，按“2.5”项下方法处理，在“2.3”项条件下进样测定。以各黄酮苷质量浓度为横坐标(X)，各黄酮苷、内标峰面积比值为纵坐标(Y)进行回归，得到方程分别为王不留行黄酮苷Y=0.001 65X+0.010 4(r=0.998 9)，线性范围10.5～2 100 μg/L，定量限10.5 μg/L；异牡荆素-2″-O-阿拉伯糖苷Y=0.001 92X+0.012 7(r=0.999 1)，线性范围9.90～1 980 μg/L，定量限9.90 μg/L；肥皂草苷Y=0.001 98X+0.011 4(r=0.999 1)，线性范围1～200 μg/L，定量限1 μg/L。

2.6.3 准确度、精密度试验 取3个质量浓度QC样品6份，每份100 μL，按“2.5”项下方法处理，在“2.3”项条件下进样测定，以所测质量浓度与实际质量浓度的比值计算日内精密度、准确度，再连续3 d检测以计算日间精密度，结果见表1，可知各黄酮苷准确度、精密度均符合相关方法学要求。

表1 各黄酮苷准确度、精密度试验结果 (n=6)

2.6.4 提取回收率、基质效应试验 取不同质量浓度QC样品各6份，每份100 μL，按“2.5”项下方法处理，在“2.3”项条件下进样测定，计算峰面积S1；取空白血浆适量，按“2.5”项下方法处理，上清液中加入不同质量浓度对照品溶液，在“2.3”项条件下进样测定，计算峰面积S2；取不同浓度对照品溶液，加入内标溶液，在“2.3”项条件下进样测定，计算峰面积S3，测定提取回收率、基质效应，公式分别为提取回收率=(S1/S2)×100%、基质效应=(S2/S3)×100%，结果见表2，可知该方法不存在明显的基质效应。

表2 各黄酮苷提取回收率及基质效应试验结果 (n=6)

2.6.5 稳定性试验 取3个质量浓度QC样品各6份，每份100 μL，置于1.5 mL离心管中，分别在室温下放置4 h、样品盘中放置24 h、-20 ℃下放置1周、-20 ℃下反复冻融3次，按“2.5”项下方法处理，在“2.3”项条件下进样测定，计算准确度，结果见表3，可知在不同条件下各黄酮苷稳定性均良好。

表3 各黄酮苷稳定性试验结果(n=6)

2.7 药动学研究 对生品组、炮制品组不同时间点的血浆样品进行蛋白沉淀后，采用UPLC-MS/MS法测定王不留行黄酮苷、异牡荆素-2″-O-阿拉伯糖苷、肥皂草苷血药浓度，DAS 3.2.6药动学软件中的非房室模型计算药动学参数，SPSS 23.0软件进行独立样本t检验，结果见表4，再通过GraphPad Prism7软件绘制血药浓度-时间曲线，见图2。由此可知，与生品组比较，炮制品组王不留行黄酮苷MRT0～24 h、t1/2缩短(P<0.05)；异牡荆素-2″-O-阿拉伯糖苷Cmax、AUC0～24 h升高(P<0.05)，MRT0～24 h、t1/2缩短(P<0.05)；肥皂草苷MRT0～24 h缩短(P<0.05)。

表4 各黄酮苷主要药动学参数

图2 各黄酮苷血药浓度-时间曲线Fig.2 Plasma concentration-time curves for various flavonoid glycosides n=6)

3 讨论

本实验首次建立了UPLC-MS/MS法同时测定大鼠血浆中王不留行黄酮苷、肥皂草苷和异牡荆素-2″-O-阿拉伯糖苷的含量，并对灌胃给予相同生药量的大鼠在各时间点的血药浓度进行测定。表4、图2显示，与生品组比较，炮制品组峰浓度、AUC0～24h均显著升高，平均驻留时间、半衰期显著降低，表明王不留行炮制后异牡荆素-2″-O-阿拉伯糖苷含量升高，在服用相同剂量提取物时其暴露量增加，消除时间加快；王不留行黄酮苷、肥皂草苷平均驻留时间显著缩短，并且前者半衰期也显著缩短，后者半衰期也有相同趋势，表明炮制品组大鼠体内两者消除加快。

分析给药剂量时发现，炮制品组异牡荆素-2″-O-阿拉伯糖苷剂量是生品组的2.24倍，达峰浓度、药时曲线下面积分别升高约2.5、1.8倍；王不留行黄酮苷、肥皂草苷给药剂量接近，在吸收程度上也无显著差异，推测炮制后前者暴露量增加可能是由于剂量导致的，炮制使王不留行中该成分含量增加，可能是导致其暴露程度增加的原因之一。在化学结构上，异牡荆素-2″-O-阿拉伯糖苷7位碳上取代基与王不留行黄酮苷不同，前者为羟基，后者为葡萄糖，而炮制升温过程会使糖苷键断裂，导致后者向前者转化。其他王不留行黄酮苷类衍生物也可能为这一转化提供物质基础，至于其他因素是否影响异牡荆素-2″-O-阿拉伯糖苷的吸收还需进一步验证。

前期预实验选取了刺桐碱、尿囊素、王不留行黄酮苷类、王不留行环肽类、stigmast-7,22-dien-3-ol-3β-O-(β-D-glucopyranoside)、segetoside A 等11种成分，分别在正、负离子模式下对入血成分进行筛选，发现负离子模式不适合做定量分析；正离子模式所测3种黄酮苷响应值均较好，二其他成分响应值过低，不适合被检测。