柚皮素-PLGA纳米粒的制备及其体内药动学研究

王晓明， 张智强

(1.郑州澍青医学高等专科学校，河南 郑州 450064；2.天津药物研究院药业有限责任公司，天津 300301)

柚皮素是一种广泛存在于芸香科植物中的二氢黄酮类化合物，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、预防动脉粥样硬化、抗纤维化等活性[1]。常温下柚皮素在水中的溶解度仅为44.52 μg/mL[2]，可能使得药物难以溶出，进而导致口服吸收生物利用度低下[3]，药效大打折扣。目前，柚皮素制剂新技术有脂质体[4]、纳米混悬剂[3]、自微乳[5]、磷脂复合物[6]等报道。

纳米制剂作为一种固体胶粒给药系统，可显著促进药物体外溶出及体内口服吸收，是大有发展前景的新型给药系统之一，其中聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)作为药物载体或组织工程材料受到了广泛关注[7-8]，已通过FDA认证，正应用于生物医学领域，并作为药物辅料正式收录于《美国药典》。本实验采用操作简单、成本低廉的纳米沉淀法将柚皮素制成PLGA纳米粒，在单因素试验基础上通过正交试验得到最优处方，再对其冻干粉末体外释放及体内药动学进行考察，以期为相关新技术开发提供参考。

1 材料

安捷伦1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；AR2240型电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；QL-901型涡旋混合器(上海之信仪器有限公司)；MS-S/MS7-S型磁力搅拌器(北京大龙磁力搅拌器)；JC-S12型方形水浴氮气吹扫仪(青岛聚创环保设备有限公司)；Nanosep®超滤离心管(截留相对分子质量10 000，美国Pall公司)；TL-ST150型超声波细胞粉碎机(江苏天令羽仪器公司)；Master-sizer型粒度分析仪(英国马尔文公司)；透析袋(美国Sigma公司，相对分子质量8～14 kDa)。

柚皮素原料药(批号170216S，纯度>98%，武汉贝尔卡生物医药有限公司)；柚皮素对照品(批号110867-201607，纯度99.5%，中国食品药品检定研究院)；聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA，型号75∶25、60∶40、50∶50，上海市协泰化工有限责任公司)；泊洛沙姆188(批号WPE1566D，德国巴斯夫公司)。

清洁级SD大鼠，雌雄兼具，购自河南省动物实验中心，动物生产许可证号SCXK(豫)2016-0001，于实验室饲养至体质量为(300±20)g。

2 方法与结果

2.1 柚皮素-PLGA纳米粒制备 由于柚皮素在大多数溶剂中的溶解度较差，只在丙酮中易溶，而且PLGA在该溶剂中也易溶，故选择丙酮作为有机相溶剂。参考文献[9]报道，称取20 mg柚皮素和一定量PLGA溶于5 mL丙酮中，作为有机相；取一定体积分数泊洛沙姆188溶液加到圆底烧瓶中，水浴加热至40 ℃并磁力搅拌，作为水相，用5号针头注射器吸取有机相，采用液下方式注入水相中，超声处理20 min，减压旋转蒸发法浓缩45 min，迅速放入-20 ℃冰箱中进行固化，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得，蒸馏水定容，形成混悬液。

2.2 柚皮素含量测定

2.2.1 色谱条件 Waters C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相乙腈-0.5%甲酸(78∶22)；体积流量1.0 mL/min；柱温为35 ℃；检测波长271 nm；进样量20 μL。

2.2.2 线性关系考察 精密称取柚皮素对照品10.00 mg，置于10 mL量瓶中，加入乙腈超声溶解，定容，作为贮备液(1.0 mg/mL)，精密量取1.0 mL至10 mL量瓶中，流动相定容至刻度，逐步稀释至0.05、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/mL，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定。以柚皮素峰面积(Y)对其质量浓度(X)进行回归，得方程为Y=3.548 2X-0.100 4(r=0.999 9)，在0.05～10.0 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.3 供试品溶液制备及方法学考察 精密量取2 mL柚皮素-PLGA纳米粒混悬液，转移至50 mL量瓶中，加入适量乙腈破乳，流动相定容，0.45 μm微孔滤膜过滤，取2 mL续滤液至10 mL量瓶中，流动相定容，即得供试品溶液。

取同一份混悬液，平行制备6份供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得柚皮素RSD为1.39%，表明该方法重复性良好。取供试品溶液适量，同一天在“2.2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得日内精密度RSD分别为0.22%、0.14%、0.39%；连续6 d，每天1次，测得日间精密度RSD分别0.77%、0.38%、0.42%，表明该方法精密度良好。取混悬液2 mL，加入贮备液0.5、1.0、1.5 mL各3份，加入乙腈超声溶解，流动相补充减失的质量，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得柚皮素平均加样回收率分别为99.48%、99.16%、99.51%，RSD分别为1.96%、0.89%、0.47%。

2.3 包封率、载药量测定 量取2.0 mL混悬液至超滤离心管中，12 500 r/min离心60 min，取续滤液，HPLC法测定游离柚皮素含量(m2)；精密量取2.0 mL混悬液至50 mL量瓶中，加入适量乙腈破坏纳米粒，流动相定容，过0.45 μm微孔滤膜，取2 mL续滤液至10 mL量瓶中，流动相定容后测定柚皮素总含量(m1)，计算包封率、载药量，公式分别为包封率=[(m1-m2)/m1]×100%、载药量=[(m1-m2)/m总]×100%，其中m总为PLGA、柚皮素总质量。

2.4 单因素试验

2.4.1 PLGA型号 固定柚皮素用量20 mg，药物与载体比例1∶15，表面活性剂(泊洛沙姆188)用量0.5%，考察PLGA型号75∶25、60∶40、50∶50对包封率、载药量、粒径、PDI、Zeta电位的影响，结果见表1。由此可知，不同型号PLGA制备时上述指标差异较大。

表1 PLGA型号对包封率、载药量、粒径、PDI、Zeta电位的影响(n=3)

2.4.2 药物与载体比例 固定柚皮素用量20 mg，泊洛沙姆188质量分数0.5%，考察药物与载体比例1∶12、1∶15、1∶18对载药量、包封率、粒径、PDI、Zeta电位的影响，结果见表2。由此可知，随着载体比例增加，包封率先明显升高后趋缓，继续增加时载药量下降明显，但对PDI、Zeta电位无明显影响[10]；两者比例为1∶15时包封率、载药量较高，粒径、PDI、Zeta电位也较理想。

表2 药物与载体比例对包封率、载药量、粒径、PDI、Zeta电位的影响(n=3)

2.4.3 油相与水相比例 固定柚皮素用量20 mg，药物与载体比例1∶15，泊洛沙姆188质量分数0.5%，考察油相与水相比例1∶6、1∶8、1∶10对载药量、包封率、粒径、PDI、Zeta电位的影响，结果见表3。由此可知，当水相比例过大时，包封率、载药量下降幅度较大，可能是在表面活性剂增溶作用下药物转移至水相中所致；随着水相增加，粒径有下降趋势，而对PDI、Zeta电位无明显影响；当两者比例为1∶8时，上述指标均较理想。

表3 油相与水相比例对包封率、载药量、粒径、PDI、Zeta电位的影响(n=3)

2.4.4 泊洛沙姆188质量分数 合适的表面活性剂质量分数对纳米粒聚集有阻滞作用[11]。固定柚皮素用量20 mg，药物与载体比例1∶15，油相与水相比例1∶8，考察泊洛沙姆188质量分数0.5%、0.75%、1.0%对载药量、包封率、粒径、PDI、Zeta电位的影响，结果见表4。由此可知，泊洛沙姆188质量分数为1.0%时，载药量、包封率降低，可能是由于其增溶作用使大量药物进入水相，导致载体未能有效包裹药物；随着其质量分数进一步增加，粒径有减小趋势，但对PDI、Zeta电位无明显影响；当其质量分数为0.75%时，上述指标均较理想。

表4 泊洛沙姆188质量分数对包封率、载药量、粒径、PDI、Zeta电位的影响(n=3)

2.5 正交试验 包封率是保证制剂安全有效的重要基础，也是PLGA纳米给药系统中重要的设计参数[12]，故正交试验以其为评价指标。在单因素试验基础上，选择PLGA型号(A)、药物与载体比例(B)、油相与水相比例(C)、泊洛沙姆188质量分数(D)作为影响因素，因素水平见表5，结果见表6，方差分析见表7。由此可知，各因素影响程度依次为A>D>C>B，A有显著影响(P<0.05)；最优处方为A1B1C2D2，即PLGA型号75∶25，药物与载体比例1∶14，油相与水相比例1∶8，泊洛沙姆188质量分数0.75%。

表5 因素水平

2.6 验证试验 取混悬液适量，蒸馏水按1∶4比例稀释后放入比色池中，测定粒径、Zeta电位，结果见图1～2，可知平均粒径为(203.51±8.14)nm，PDI为0.193±0.021，Zeta电位为(-34.2±3.0)mV。再按“2.3”项下方法测定包封率、载药量，测得两者分别为(84.06±1.66)%、(5.21±0.53)%，表明所得柚皮素-PLGA纳米粒分布均匀，包封率高，重复性好。

表6 试验设计与结果

表7 方差分析

图1 柚皮素-PLGA纳米粒粒径分布Fig.1 Particle size distribution of naringenin-PLGA nanoparticles

图2 柚皮素-PLGA纳米粒Zeta电位Fig.2 Zeta potential of naringenin-PLGA nanoparticles

2.7 冻干粉制备

2.7.1 冷冻干燥工艺 在混悬液中加入冻干保护剂，溶解混匀后转移至西林瓶中，放到冷冻干燥机内，在-40 ℃下预冻6 h，开启真空泵，保持3 h，4 h内温度升至-25 ℃，保持3 h，4 h内升温至-15 ℃，保持3 h，4 h内升温至0 ℃，保持3 h，12 h内升温至25 ℃，保持3 h，即得，取出后迅速密封。见图3。

图3 冻干粉外观Fig.3 Appearance of lyophilized powder

2.7.2 冻干保护剂种类筛选 本实验选择甘露醇、乳糖、蔗糖进行考察，并考察其质量分数为4%、5%、6%时对粒径、包封率的影响，结果见表8。由此可知，以4%甘露醇为冻干保护剂时，粒径、包封率变化程度最小。

表8 冻干保护剂种类对粒径、包封率的影响(n=3)

2.8 体外释药研究 取柚皮素及其PLGA纳米粒冻干粉适量，空白溶出介质制成混悬液后置于透析袋中(柚皮素含量为20 mg)，两端扎紧，以0.75%SDS溶液为释放介质(达漏槽条件)，设定体积为900 mL，转速为100 r/min，温度为(37±1) ℃，在预定时间点各取样3 mL，同时补加3 mL 0.75%SDS溶液，计算药物释放量，绘制体外释放曲线，结果见图4。由此可知，原料药在8 h累积释放度基本达到最大，但仍不足30%；PLGA纳米粒在各时间点的累积释放度均高于原料药，36 h内达到81.07%，体外释药符合Weibull模型，见表9。

2.9 药动学研究

2.9.1 灌胃液制备及大鼠采血 取冻干粉适量(以柚皮素计10 mg)，加入3 mL蒸馏水摇匀，即得灌胃液；另取柚皮素10 mg，同法制备相应灌胃液。取12只大鼠，随机分为2组，每组6只，灌胃给药(40 mg/kg)，柚皮素组于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10 h眼眶采血，柚皮素-PLGA纳米粒组于0、0.5、1、2、2.5、3、4、5、6、8、10、12 h眼眶采血，采血量均约为0.25 mL，将血样置于肝素化的离心管中摇匀以防止凝血，2 500 r/min离心5 min，取上层浅黄色血浆，置于-20 ℃冰箱中，测定前室温解冻。

图4 柚皮素体外释放曲线(n=6)Fig.4 In vitro release curves for naringenin (n=6)

表9 柚皮素释药模型拟合结果

2.9.2 血浆样品处理 参考文献[3]报道的方法，并略作调整。取100 μL血浆样品至离心管中，加入1.5%甲酸50 μL，振荡后加入2 mL乙酸乙酯，涡旋6 min得混悬液，8 000 r/min离心20 min，分离上层乙酸乙酯至2 mL离心管中，置于45 ℃氮吹仪中吹干，于残渣中加入100 μL乙腈复溶。

2.9.3 方法学考察 取5.0 μg/mL对照品溶液，乙腈稀释至1 500、1 000、500、100、50、25 ng/mL，分别取100 μL，置于45 ℃氮吹仪中吹干，于残渣中加入100 μL空白血浆，即得血浆对照品溶液，按“2.9.2”项下方法处理，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定。以柚皮素峰面积(Y)对其质量浓度(X)进行回归，得方程为Y=0.025 4X+2.617 6(R2=0.990 7)，在25～1 500 ng/mL范围内线性关系良好。

取血浆样品适量，于0、4、8、12、16、24 h在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得柚皮素峰面积RSD为1.42%，表明样品在24 h内稳定性良好。取25、500、1 500 ng/mL血浆对照品溶液适量，同一天在“2.2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得日内精密度RSD分别为1.92%、1.55%、1.02%；连续6 d，每天1次，测得日间精密度RSD分别为5.92%、5.14%、6.63%，表明该方法精密度良好。取上述3种质量浓度血浆对照品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得柚皮素平均加样回收率分别为92.93%、100.48%、96.17%，RSD分别为5.16%、4.04%、3.48%。

2.9.4 结果分析 图5、表10显示，与原料药比较，PLGA纳米粒tmax延长(P<0.01)，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.01)，相对生物利用度增加至4.12倍。

图5 柚皮素血药浓度-时间曲线(n=6)Fig.5 Plasma concentration-time curves for naringenin (n=6)

表10 柚皮素主要药动学参数

3 讨论

纳米混悬剂粒径在200 nm左右时，可有效通过肠道Peyer’s patch进入血液循环，从而获得较高生物利用度[13-14]。单因素试验发现，柚皮素-PLGA纳米粒的粒径均在200 nm左右，而且PDI值均小于0.3，表明粒径分布较为均一[15]，故正交试验只选择包封率作为评价指标。

王元文[4]制备的柚皮素脂质体包封率较低，仅为72.2%，采用自微乳技术[5]尽管可提高溶解度，促进药物吸收，但需用大量表面活性剂或助表面活性剂，存在一定安全隐患。本实验发现，柚皮素-PLGA纳米粒包封率达(84.06±1.66)%，并且表面活性剂用量大大降低；相对口服吸收生物利用度增加至4.12倍，可能是由于制成PLGA纳米粒后能促进药物溶出；t1/2由(2.76±0.41)h延长至(5.83±0.73)h，增加了药物体内循环时间；纳米药物可通过肠道Peyer’s patch进入体循环[16]，有助于降低首过效应[17]，促进药物高效吸收；tmax显著延后，可能是由于PLGA纳米粒粘附于胃肠道壁或滞留于绒毛间隙，最终延缓了药物吸收[18]。