坚杆火绒草质量标准的研究

赵雪莲， 李奕松， 苏宏娜， 谭 玲， 李文兵， 杨正明*， 刘 圆

(1.西南民族大学药学院，四川 成都 610041；2.四川省羌彝药用资源保护与利用技术工程实验室，四川 成都 610225；3.青藏高原民族药用资源保护与利用国家民委重点实验室，四川 成都 610225；4.西南民族大学青藏高原研究院，四川 成都 610041；5.西南民族大学民族医药研究院，四川 成都 610041)

坚杆火绒草为菊科植物坚杆火绒草LeontopodiumfranchetiiBeauv.的干燥全草[1]，是藏医临床特色外治疗法——火灸中的重要原材料，藏药名“扎瓦”或“扎托巴”[2]，使用历史悠久，疗效确切，收载于《晶珠本草》[3]《藏医镜晶本草》[4]《中华藏本草》[5]《藏药志》[6]《中国藏药》[7]等藏医书籍中。火绒草属植物化学成分较多，主要为有机酸、黄酮、挥发油、倍半萜、苯丙素类、甾体等[8-10]，其中绿原酸具有抗菌、消炎活性[11-12]，3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸还具有抗氧化作用[13]。坚杆火绒草蕴藏量丰富，但尚未建立其质量标准，故本实验拟对该药材进行原植物、性状鉴别、显微鉴别、薄层鉴别、含量测定、常规项检查等研究，以期为建立2021年版《四川省藏药材标准》提供数据支撑。

1 材料

1.1 仪器 DGU-20A液相色谱仪、ATY124电子天平、AUW220D电子天平(日本Shimadzu公司)；洁盟超声波清洗机(深圳洁盟清洗设备有限公司)。

1.2 试剂与药物 绿原酸(批号18071907)、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸(批号19061201)对照品(成都普菲德生物技术有限公司)。硅胶GF254薄层板。乙腈、磷酸为色谱纯；乙醇及其余试剂均为分析纯；水为超纯水。

1.3 药材 坚杆火绒草共6批，由西南民族大学刘圆教授鉴定为菊科植物坚杆火绒草LeontopodiumfranchetiiBeauv.的干燥全草，具体信息见表1。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 鉴别

2.1.1 原植物 多年生草本；须根众多，表皮黑褐色，内质黄白色；根状茎粗壮，近横走，有多数密集簇生的花茎和不育的幼茎，无莲座状叶丛；茎直立，高15～50 cm，被黄色短柄的密腺，上部还稍有蛛丝状毛，整株被有具密生的叶；叶直立或稍开展，线形，长约1～3 cm，宽0.1～0.3 cm，有明显的尖头，除叶脉和叶基部外，还被有密压的白色棉毛；苞叶多数，线形，长约5～10 mm，宽1～2 mm；头状花序，直径3～5 mm，10～30个或更多，密集或稍分散；花冠长2～3 mm，浅黄色或灰白色，雄花花冠狭漏斗状；雌花花冠丝状；瘦果有短粗毛。花期7～9个月。

2.1.2 性状 长10～30 cm；根状茎粗短，木质；须根众多，表皮黑褐色，内质黄白色；茎直立，圆柱形，质脆，易折断，密被灰白色棉毛；叶多反卷皱缩，脱落，完整者展开呈线形，顶端有明显的尖头，两面密被白色茸毛；苞叶多数，多反卷皱缩，展开后呈线形，顶端稍钝或近圆形，两面密被较厚的黄白色茸毛；头状花序密集，冠毛白色；气微香，味微苦。

2.1.3 显微 粉末(水合氯醛透化，稀甘油装片)黄棕色；表皮细胞多呈蝶片状或不规则状；气孔为不定式或平轴式，副卫细胞2～7个；非腺毛单细胞，多弯曲，长56～830 μm，壁较厚，微具细密疣状突起；薄壁细胞，呈圆形；石细胞单个散在或者数个成群，呈类圆形、类方形、类长形，壁厚、纹孔明显、胞腔大含黑色内含物，直径5～10 μm；筛管分子筛板、筛孔明显；梯纹导管，直径7～20 μm；螺纹导管多见，直径10～32 μm；木纤维淡黄色，长梭形，多成束，直径14～26 μm，壁稍厚，木化；花粉粒众多，圆球形，直径23～59 μm，有3个萌发孔，表面密布短刺及细颗粒状雕纹。见图1。

注：1～10分别为表皮细胞、气孔、非腺毛、薄壁细胞、石细胞、筛管、螺纹导管、梯纹导管、木纤维、花粉粒。图1 坚杆火绒草显微鉴别Fig.1 Microscopic identification of L. franchetii

2.1.4 TLC定性鉴别 取药材粉末(过三号筛)2.0 g，加50 mL甲醇加热回流1 h，滤过，滤液浓缩至5 mL，即得供试品溶液；取绿原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品适量，甲醇制成每1 mL含两者各1 mg的对照品溶液。按照2020年版《中国药典》四部通则0502薄层色谱法，吸取上述溶液各10 μL，点于同一硅胶GF254薄层板上，以乙酸丁酯∶甲酸∶水(7∶7∶7)上层溶液为展开剂，展开，晾干，在紫外灯(365 nm)下检视，结果见图2。由此可知，供试品在相应对照品位置上显相同颜色的斑点，而且图像清晰。

注：R1、R2分别为绿原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品，1～ 6为6批药材。图2 坚杆火草TLC色谱图Fig.2 TLC chromatogram of L. franchetii

2.2 水分、灰分、浸出物含量测定 按照2020年版《中国药典》四部通则[14]，对水分(通则0832第四法)、总灰分(通则2302)、酸不溶性灰分(通则2302)、浸出物(通则2201)进行检查，结果见表2。

表2 水分、灰分、浸出物含量测定结果

2.3 绿原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量测定 参考文献[15-17]报道。

2.3.1 色谱条件 Kromasi Dimensions C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相乙腈(A)-水(含0.2%磷酸)(B)，梯度洗脱(0～5 min，10%～15%A；5～10 min，15%～20%A；10～35 min，20%A)；体积流量1.2 mL/min；柱温35 ℃；检测波长327 nm；进样量10 μL。色谱图见图3。

1.绿原酸 2.3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸1.chlorogenic acid 2.3,5-dicaffeoylquinic acid图3 各成分HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 供试品溶液制备 取本品粉末(过3号筛)约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 50%乙醇，称定质量，超声(功率200 W、频率40 kHz)处理30 min，放冷，50%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3.3 线性关系考察 精密称取绿原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品适量，50%乙醇定容至50 mL，得质量浓度分别为0.246、0.332 mg/mL的贮备液，置于4 ℃冰箱中保存，准确吸取适量，制成多个质量浓度，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定。以各成分质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得方程分别为绿原酸Y=3×107X+14 481(R2=0.999 9)，在0.009 952～0.124 4 mg/mL范围内线性关系良好；3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸Y=3×107X-60 903(R2=0.999 9)，在0.008 3～0.166 0 mg/mL范围内线性关系良好。

2.3.4 精密度试验 精密吸取含0.049 76 mg/mL绿原酸、0.066 4 mg/mL 3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸的对照品溶液10 μL，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定6次，测得绿原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸峰面积RSD分别为0.20%、0.73%，表明仪器精密度良好。

2.3.5 稳定性试验 精密吸取供试品溶液(hrc-4)适量，于0、5、10、15、20、30 h在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，测得绿原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸峰面积RSD分别为0.82%、1.18%，表明溶液在30 h内稳定性良好。

2.3.6 重复性试验 精密称取药材(hrc-4)粉末6份，每份0.5 g，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样10 μL测定，测得绿原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量RSD分别为1.13%、0.89%，表明该方法重复性良好。

2.3.7 加样回收率试验 精密称取药材(hrc-4)粉末6份，每份0.25 g，置于具塞锥形瓶中，加入1.85 mL绿原酸对照品溶液、2.65 mL 3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品溶液、45.5 mL 50%乙醇，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表3。

表3 各成分加样回收率试验结果(n=6)

2.3.8 样品含量测定 取6批药材，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，外标法计算含量，结果见表4。

表4 各成分含量测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 TLC鉴别 本实验首先考察不同比例乙酸丁酯-甲酸-水(7∶7∶7、7∶5∶5、7∶2.5∶2.5、7∶2.5∶5)的展开体系，发现在7∶7∶7比例下斑点清晰，分离度好。再考察硅胶G板、GF254板、聚酰胺薄膜，发现硅胶GF254板展出斑点分离完全，成像清晰，效果理想。

3.2 水分、灰分、浸出物限量 结合2020年版《中国药典》四部通则及“药材和饮片检定通则”相关要求，暂定坚杆火绒草中水分不得超过13%，总灰分不得超过13%，酸不溶性灰分不得超过6%，浸出物不得少于12%。

3.3 绿原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸限量 6批坚杆火绒草中绿原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量有显著差异(P<0.01)，以坚杆火绒草干品为计，暂定两者含量分别不得低于0.14%、0.28%。

4 结论

本实验填补了藏药坚杆火绒草质量标准的空白，为制定四川省藏药材质量标准提供参考。另外，以绿原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸为指标成分时，可降低检验成本，增加准确性，提高质量控制可行性。