芪箭消瘿方对自身免疫性甲状腺炎大鼠甲状腺炎症损伤的作用

牧亚峰， 左新河,*， 向 楠,*， 赵 勇， 华 川,， 陈继东,

(1.湖北中医药大学，湖北 武汉 430061；2.湖北省中医院甲状腺疾病诊疗中心，湖北 武汉 430074)

自身免疫性甲状腺炎(autoimmune thyroiditis，AIT)，也称为桥本甲状腺炎，是最常见的自身免疫性甲状腺疾病。流行病学调查显示，AIT患病率为0.03%～0.15%[1],已成为导致原发性甲状腺功能减退症的首要因素[2]。目前，本病尚没有特效药物，病情进展为甲减可能需要甲状腺激素终生替代治疗，因此，亟待需要寻找有效的防治方法。

AIT的发生涉及一系列复杂的致病机制，主要与甲状腺自身抗体介导、细胞因子失衡、细胞凋亡等病理过程有关。Toll样受体4(toll like receptor 4，TLR4)是甲状腺细胞上广泛存在的模式识别受体，可通过识别结合内源性分子激活先天免疫应答[3]。经配体刺激的TLR4可与下游的髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)结合，导致核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)激活并产生促炎细胞因子，对免疫应答和炎症反应过程起重要作用[4]。研究发现，TLRs及下游靶标MyD88在AIT患者外周血单个核细胞及血清中高表达[5]。正常大鼠甲状腺细胞有TLR4及其辅助分子的表达[6]，该证据表明甲状腺细胞具有激活先天免疫反应的能力。由此提示，TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活可能参与AIT的发病机制。

芪箭消瘿方是全国名中医陈如泉教授治疗AIT的经验方，具有较好的临床疗效。本课题前期研究[7]发现芪箭消瘿方能够降低AIT小鼠TGAb、TPOAb水平，减轻甲状腺组织淋巴细胞浸润，改善免疫紊乱状态。本实验在前期研究基础上，围绕TLR4/MyD88/NF-κB信号通路探讨芪箭消瘿方对AIT大鼠作用的潜在机制，为临床应用提供科学依据。

1 材料

1.1 动物 SPF级6周龄雌性SD大鼠48只，体质量 (110±10) g，由三峡大学提供，动物生产许可证号SCXK(鄂)2017-0012，饲养于湖北中医药大学实验动物中心，温度 (23±2) ℃，相对湿度 (55±10)%，昼夜明暗12 h/12 h，自由摄食饮水。本实验经湖北中医药大学动物伦理委员会批准。

1.2 药物 芪箭消瘿方主要组方药材为黄芪30 g、白芍15 g、鬼箭羽15 g、穿山龙15 g(江阴天江药业有限公司生产，由湖北省中医院中药配方颗粒药房调配)。硒酵母片(牡丹江灵泰药业有限公司，批号H10940161)。

1.3 试剂 猪甲状腺球蛋白、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂(美国Sigma公司，批号分别为180801、F5881、F5506)；FT3、FT4、IFN-γ、TNF-α试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号分别为0079c、0122c、R0009c、R2856c)；TPOAb试剂盒(武汉华美生物工程有限公司，批号E11199r)；TGAb试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司，批号R0551)；Trizol(美国Ambion公司，批号15596-026)；HiScript Reverse Transcriptase、SYBR Green Master Mix for qPCR(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，批号分别为R101-01/02、Q111-02)；TLR4、NF-κB p65抗体(武汉三鹰生物技术有限公司，批号分别为19811-1-AP、13409-1-AP)；MyD88抗体(武汉爱博泰克生物科技有限公司，批号A0980)；IKKβ、p-IKKβ(北京博奥森生物技术有限公司，批号分别为4880R、3232R)；β-actin、山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司，批号分别为BM0627、BA1051、BA1054)。

1.4 仪器 离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)；多功能酶标仪(美国MD公司)；轮转式切片机(德国Leica公司)；荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；垂直电泳槽、电转仪(北京六一仪器厂)；光学显微镜(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 造模 采用高碘水喂养联合皮下注射猪甲状腺球蛋白与弗氏佐剂诱导建立AIT大鼠模型[8]。适应性喂养后，自实验第2～7周分别于大鼠皮下多点予以2次初次免疫、4次加强免疫，每周1次，每次注射猪甲状腺球蛋白100 μg/只，同时给予碘化钠水(0.64 g/L)喂养，造模期间大鼠自由饮水。

2.2 分组及给药 48只大鼠随机分为对照组、模型组、硒酵母组及芪箭消瘿方低、中、高剂量组，每组8只。自实验第7周开始，对照组和模型组大鼠给予等体积生理盐水灌胃，硒酵母组大鼠给予硒酵母混悬液(36 μg/kg)灌胃，芪箭消瘿方低、中、高剂量组大鼠分别给予芪箭消瘿方(1.8、3.6、7.2 g/kg)灌胃，每天1次，连续6周，于实验第12周结束后取材，剂量按大鼠与人等效剂量折算系数换算。

2.3 指标检测

2.3.1 ELISA法 大鼠采血后静置1～2 h，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取得血清，按照相关ELISA试剂盒说明书检测FT3、FT4、TGAb、TPOAb、TNF-α、IFN-γ水平。

2.3.2 HE染色 大鼠采血后冰上快速分离气管两侧甲状腺组织，一部分置于-80 ℃冰箱中保存备用，另一部分浸泡于4%多聚甲醛中固定，制成4 μm厚切片，进行苏木素-伊红(HE)染色，在显微镜下观察拍照。参照Verginis等[9]制定的甲状腺组织炎症评分标准对其进行打分，具体为0分，无淋巴细胞浸润；1分，2个或3个甲状腺滤泡之间的间质可见淋巴细胞浸润；2分，1个或2个甲状腺滤泡大小的浸润灶；3分，广泛浸润面积达10%～40%；4分，广泛浸润面积达40%～80%；5分，广泛浸润面积达80%以上。

2.3.3 RT-qPCR法 Trizol法提取总RNA，逆转录合成cDNA，RT-qPCR法检测待测基因，反应条件为50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃30 s，40个循环。反应结束后进行熔解曲线分析，采用2-ΔΔCT法计算数据，以β-actin为内参基因，引物由武汉巴菲尔生物技术服务有限公司合成提供，序列见表1。

表1 引物序列

2.3.4 Western blot法 取剪碎的大鼠甲状腺组织，加入含磷酸酶抑制剂的裂解液后匀浆，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，取上清液，检测蛋白浓度。制备10% SDS-PAGE凝胶，蛋白上样，电泳分离转膜，TBST封闭，将膜浸泡于稀释后的一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，浸入稀释后的二抗(1∶50 000)，37 ℃孵育2 h，ECL显影曝光，扫描胶片，BandScan软件分析条带灰度值。

3 结果

3.1 芪箭消瘿方对大鼠血清FT3、FT4水平的影响 如图1所示，与对照组比较，模型组大鼠血清FT3、FT4水平增加(P<0.01)；与模型组比较，各给药组大鼠血清FT3、FT4水平减少(P<0.05，P<0.01)。

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。图1 各组大鼠血清FT3、FT4水平Fig.1 Serum FT3 and FT4 levels of rats in each group

3.2 芪箭消瘿方对大鼠甲状腺组织病理的影响 如图2A所示，对照组大鼠甲状腺滤泡结构完整，形态规则，呈类圆形或多边形，滤泡上皮细胞呈单层立方形，排列整齐，滤泡腔内充满胶质，滤泡间隙未见淋巴细胞浸润；模型组大鼠甲状腺滤泡上皮细胞呈扁平状，大部分滤泡结构破坏萎缩，可见弥漫性淋巴细胞浸润；硒酵母组大鼠甲状腺滤泡上皮细胞排列尚整齐，滤泡腔萎缩，胶质水平减少，可见吸收空泡；芪箭消瘿方各剂量组大鼠甲状腺滤泡结构完整性改善，淋巴细胞浸润明显减少，病变程度有所减轻。如图2B所示，与对照组比较，模型组大鼠甲状腺组织炎症评分增加(P<0.01)，而各给药组大鼠甲状腺组织炎症评分较模型组降低(P<0.01)。

注：箭头处为淋巴细胞聚集。与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01。图2 各组大鼠甲状腺组织形态学变化 (HE，×100)Fig.2 Histological changes of rat thyroid in each group (HE，×100)

3.3 芪箭消瘿方对大鼠血清TGAb、TPOAb水平的影响 如图3所示，与对照组比较，模型组大鼠血清TGAb、TPOAb水平升高(P<0.01)；与模型组比较，各给药组大鼠血清TGAb、TPOAb水平降低(P<0.05，P<0.01)。

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。图3 各组大鼠血清TGAb、TPOAb水平Fig.3 Serum TGAb and TPOAb levels of rats in each group

3.4 芪箭消瘿方对大鼠血清IFN-γ、TNF-α水平的影响 如图4所示，与对照组比较，模型组大鼠血清IFN-γ、TNF-α水平升高(P<0.01)；与模型组比较，各给药组大鼠血清IFN-γ、TNF-α水平降低(P<0.05)。

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。图4 各组大鼠血清IFN-γ、TNF-α水平Fig.4 Serum IFN-γ and TNF-α levels of rats in each group

3.5 芪箭消瘿方对大鼠甲状腺组织TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA表达的影响 如图5所示，与对照组比较，模型组大鼠甲状腺组织TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA表达升高(P<0.01)；与模型组比较，硒酵母组及芪箭消瘿方中、高剂量组大鼠甲状腺组织TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA表达降低(P<0.01)。

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01。图5 各组大鼠甲状腺组织TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA表达Fig.5 mRNA expressions of TLR4, MyD88 and NF-κB p65 of rat thyroid tissue in each group

3.6 芪箭消瘿方对大鼠甲状腺组织TLR4/MyD88/NF-κB相关通路蛋白表达的影响 如图6所示，与对照组比较，模型组大鼠甲状腺组织TLR4、MyD88、IKKβ、p-IKKβ、NF-κB p65蛋白表达升高(P<0.01)；与模型组比较，硒酵母组及芪箭消瘿方中、高剂量组大鼠甲状腺组织TLR4、MyD88、IKKβ、p-IKKβ、NF-κB p65蛋白表达降低(P<0.01)。

注：A为蛋白条带，B为蛋白表达。与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01。图6 各组大鼠甲状腺组织TLR4/MyD88/NF-κB通路相关蛋白表达Fig.6 Expressions of TLR4/MyD88/NF-κB pathway related proteins in rat thyroid tissues of each group

4 讨论

自身免疫性甲状腺炎(AIT)是一种T细胞介导的器官特异性自身免疫性疾病，表现为淋巴细胞浸润甲状腺，导致甲状腺细胞凋亡，并伴有TGAb、TPOAb的产生。异原性抗原免疫法通过摄入过量碘或甲状腺球蛋白免疫，可使易感大小鼠品系轻松诱发，是国际公认的AIT经典模型之一[10]。本研究模型组大鼠TGAb、TPOAb水平升高，甲状腺组织形态结构破坏且炎症评分增高，表明AIT动物模型诱导成功。国内一项多中心、前瞻性研究发现补硒治疗可以有效降低AIT患者TPOAb水平[11]。目前，硒酵母广泛应用于AIT的临床治疗，故将其作为阳性对照药。给予芪箭消瘿方后，大鼠血清中TGAb、TPOAb水平及炎症评分降低，甲状腺组织炎症浸润有不同程度改善，这与前期研究[7]结果基本一致。当甲状腺滤泡上皮细胞因炎症破坏后，储存在滤泡中的大量甲状腺激素释放入血，FT3、FT4可一过性升高[12]，这一现象也在本实验及文献[13]中得到证实。经芪箭消瘿方干预后，FT3、FT4水平下降。有研究表明穿山龙有降低FT3、FT4的作用[14]，说明芪箭消瘿方对AIT大鼠甲状腺功能的抑制作用可能与方中穿山龙的药理作用有关。

TNF-α和IFN-γ是Th1细胞免疫应答过程中释放的关键细胞因子[15]，而Th1/Th2细胞因子失衡在AIT的发病过程中发挥重要作用，以Th1细胞因子占主导地位[16-17]。TNF-α是炎症反应及细胞凋亡的主要介质，与IFN-γ广泛存在于AIT甲状腺慢性炎症环境中[18]。二者协同作用不仅可以持续加强AIT的病理过程，还可通过甲状腺细胞的凋亡诱导甲状腺组织炎症损伤[19]。研究发现，阻断TNF-α能够调节AIT大鼠甲状腺促炎细胞因子的产生及细胞凋亡的表达，有助于甲状腺组织炎症消退并抑制其纤维化[20]。本研究模型组大鼠血清TNF-α、IFN-γ水平升高，与上述文献报道一致。芪箭消瘿方干预后，促炎细胞因子水平降低，这和其他中药研究结果相似[21]。

炎症反应是免疫系统与受损组织之间相互作用的结果，而TLR4/MyD88/NF-κB信号通路则在机体炎症与免疫的调节中扮演重要角色[22,4]。TLR4是人类目前研究最深入的TLRs之一，可通过识别脂多糖、DNA片段等内源性分子与胞内的MyD88结合启动依赖性途径[23]；NF-κB是引发下游炎症的关键因素,下游的IKKβ磷酸化后激活IKK，促使NF-κB移位进入细胞核，最终促使TNF-α、IFN-γ等促炎因子表达[24]。而TNF-α又能够反过来激活NF-κB，启动TNF-α的转录，形成环路加重炎症损伤[25]。体外研究证实TLR4可在FRTL-5细胞中表达，并能通过识别脂多糖活化NF-κB[26]。后又有学者通过刺激甲状腺细胞上的TLR4而促进促炎因子的表达[27]。祁岗等[28]发现AIT大鼠中NF-κB通路的持续激活可启动Bcl-2和ICAM-1基因表达，促使炎症细胞增殖、浸润甲状腺组织。本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠甲状腺组织中TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关基因及其蛋白表达升高，表明该通路被激活。给予药物干预后，硒酵母组及芪箭消瘿方中、高剂量组TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关基因及其蛋白表达降低，表明该信号通路被抑制。李嫚等[29]也发现中药制剂夏枯草胶囊可通过抑制AIT大鼠NF-κB信号通路的活化，改善甲状腺功能并减轻甲状腺组织炎症反应。

AIT在中医学中属“瘿病”范畴，病因多与先天禀赋、体质因素、水土因素等有关。主要病机为气郁化火伤及气阴，迁延日久耗伤正气，形成气阴两虚，气滞、痰浊、瘀血结于颈前而成。本病存在虚实夹杂之象，治宜标本兼治；只用益气扶正，则有形之邪难消；单用活血化痰之药，难收正本清源之效。因此陈如泉教授主张益气养阴、活血化痰联合应用，使病因消失、病理产物清除，达到正复邪祛[30]，并根据临床经验及国内外研究成果设立芪箭消瘿方，重用甘温之黄芪为君以益气扶正；臣以白芍柔肝敛阴；佐以鬼箭羽活血行气；穿山龙活血之余兼能化痰，共奏益气养阴，化痰活血之功。

综上所述，芪箭消瘿方可能通过调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路关键蛋白的表达，减少促炎细胞因子的产生，改善甲状腺组织炎症损伤，起到保护甲状腺的作用。然而，对于芪箭消瘿方调节免疫降低抗体水平的其他可能机制以及如何通过复杂通路减少细胞凋亡来改善甲状腺炎症损伤，仍需进一步研究。