清宣止咳颗粒止咳、祛痰、抗炎作用评价

梁 婷， 黄 露， 曹征宇

(中国药科大学中药学院，江苏 南京 211198)

咳嗽是呼吸系统常见症状之一，是保持呼吸道通畅和保护肺部免受潜在有害物质侵害的一种防御性反射[1]。上呼吸道感染或普通感冒是咳嗽最常见的原因，感染后咳嗽、不明原因的慢性咳嗽、以及由哮喘、慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化和肺癌等肺部疾病也会引起咳嗽[2]。咳嗽按照持续时间的长短分为急性咳嗽、亚急性咳嗽及慢性咳嗽[2-5]。目前市场上的止咳药物主要分为中枢性镇咳药物和外周性镇咳药物[6]，如中枢作用的止咳药通常有神经副作用，如镇静和产生依赖性，因此常常被限制使用[7]。非处方(OTC)药常被用作急性咳嗽的一线治疗药物，但是由于目前缺乏充分的临床研究证明OTC药止咳的疗效[8]，因此评价市售OTC药的止咳疗效是现在亟待解决的问题。

清宣止咳颗粒是由张珍玉教授在民间验方的基础上研制而成的纯中药制剂，方中桑叶甘苦性凉，薄荷辛凉，疏风散热共为君药；杏仁、枳壳苦降，桔梗辛散，祛咳止痰共为臣药；紫菀味苦温而不热，白芍味酸敛阴，陈皮苦温行滞化痰共为佐药；甘草调和诸药为使药[9]。目前为止，对于清宣止咳颗粒的临床疗效研究证明其确可缩短小儿急性支气管炎(外感风热型咳嗽)病程，但其祛咳、止痰、抗炎的基础研究报道较少，作用机制还有待深入研究。本研究根据清宣止咳颗粒的功能主治，结合小儿外感风热咳嗽的临床表现[10-15]，建立整体动物模型对清宣止咳颗粒的止咳、祛痰、抗炎作用进行评价，为清宣止咳颗粒的临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 试剂与药物 清宣止咳颗粒(江苏苏中药业集团股份有限公司，批号08120316)；复方甘草片(南京白敬宇制药有限责任公司，批号20180308)。0.9%氯化钠注射液(华润双鹤药业股份有限公司，批号200707)；脂多糖(美国Sigma公司，批号1001003477)；地塞米松[阿拉丁试剂(上海)有限公司，批号07408]；髓过氧化物酶(MPO)测试盒(比色法)(南京建成生物工程研究所，货号A044-1-1)；白介素-1β(IL-1β)检测试剂盒(南京金益柏生物科技有限公司，货号JEB-12787)。氨水(南京南试化学试剂有限公司，批号170213)；氯化铵、苯酚红(西陇化工股份有限公司，批号160121、170416)；氢氧化钠(西陇科学股份有限公司，批号141121)；水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，批号161011)。

1.2 动物 SPF级ICR小鼠，雄性，8周龄，体质量21～25 g，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，动物使用许可证号SYXK 2016-0011。所有实验方案均得到中国药科大学动物伦理和使用委员会批准。

1.3 仪器 紫外分光光度计(日本岛津公司，型号UV-2550)；分析天平(万分之一，美国奥豪斯公司，型号PX224ZH/E)；超声振荡器(济宁亨达超声设备有限公司，型号PS-20T)；尼康显微镜(日本尼康公司，型号MA-100)。

2 方法

2.1 小鼠氨水引咳模型建立

2.1.1 分组与给药 60只雄性ICR小鼠适应性喂养2～3 d后，按照体质量随机分为空白组，模型组，清宣止咳颗粒1、2.5、5 g/kg组，复方甘草片组，每组10只，分别灌胃给予蒸馏水、清宣止咳颗粒和复方甘草片(0.12 g/kg)，给药量均为0.2 mL/10 g。

2.1.2 造模 按“2.1.1”项下方法分组并给药1 h后，在倒扣500 mL烧杯中放入1个棉球，注入300 μL 25%氨水，饱和1 min后迅速将小鼠放入其中，45 s后取出，放于另1个倒扣的干净500 mL烧杯中，观察典型咳嗽动作(腹肌收缩，同时张大嘴，有咳声)，记录咳嗽潜伏期(从取出开始计时到第1次咳嗽的时间)及5 min内咳嗽次数。观察结束后，收集小鼠肺组织进行HE染色及病理评价。空白组小鼠不给予氨水刺激，直接取下肺组织进行病理评价。

2.2 小鼠气管泌红模型建立

2.2.1 分组与给药 60只雄性ICR小鼠适应性喂养2～3 d后，按照体质量随机分为空白组，模型组，清宣止咳颗粒1、2.5、5 g/kg组，氯化铵组，每组10只，分别灌胃给予蒸馏水、清宣止咳颗粒、氯化铵(1 g/kg)，给药量均为0.2 mL/10 g。

2.2.2 造模 按“2.2.1”项下方法分组并给药4 d，末次给药30 min后除空白组小鼠腹腔注射生理盐水外，其余各组小鼠腹腔注射5%酚红(生理盐水溶解，加入1 mol/L NaOH助溶)，注射量为0.1 mL/10 g，30 min后脱颈椎处死小鼠，剥去气管周围组织，剪下自甲状软骨至气管分支处的一段气管，放入盛有2 mL生理盐水、0.1 mL 1 mol/L NaOH的试管中，超声振荡30 min，以上述混合溶液为空白对照，采用紫外分光光度计于546 nm处波长测定吸光度，以吸光度与气管质量的比值分析祛痰效果。

2.3 小鼠急性肺损伤模型建立

2.3.1 分组与给药 48只雄性ICR小鼠随机分为假手术组，脂多糖组，脂多糖+清宣止咳颗粒1、2.5、5 g/kg组，地塞米松组，每组8只，分别灌胃给予蒸馏水、清宣止咳颗粒、地塞米松(5 mg/kg)，给药量均为0.2 mL/10 g。

2.3.2 造模 小鼠灌胃给药1 h后，4%水合氯醛(0.1 mL/10 g)麻醉，将头后仰固定在自制的木板上，颈部脱毛，局部碘伏消毒，切开颈部正中皮肤，切口长约1 cm，钝性分离皮下组织及肌肉，暴露气管，将输液器针头经气管前壁插入气管内。脂多糖组、清宣止咳颗粒不同剂量组、地塞米松组小鼠气管内滴注脂多糖溶液(5 mg/kg)，采用注射器冲入约1 mL空气，以确保脂多糖溶液全部进入小气道及肺泡腔；假手术组小鼠滴注等体积生理盐水，滴入完成后缝合切口，放在温暖环境中复苏。

2.3.3 肺泡灌洗液(BALF)收集 小鼠气管内滴注脂多糖/生理盐水6、24 h后，颈椎脱臼法处死，固定在自制木板上，打开胸腔，暴露气管及双肺，手术线结扎左肺门，沿气管前壁插入10 mL注射器磨平的针头，并用丝线将其固定在气管内，结扎针头两端，注射器针头每次注入生理盐水0.5 mL，反复冲洗3～5次，将冲洗液吸出，再注入新生理盐水，同法灌洗支气管肺泡2次，回收率约为80%。将回收的BALF立即放入低温高速离心机中，4 ℃、3 000 r/min离心5 min，取上清液，保存于-80 ℃冰箱中。

2.3.4 肺组织匀浆液制备 将小鼠左肺下叶组织用预冷的生理盐水漂洗，洗去血液，滤纸吸干，称定质量，在冰水浴中剪碎，加入组织质量9倍的冷生理盐水研磨匀浆，将匀浆液转移到EP管中，放于冰上供后续指标测定。

2.3.5 肺组织匀浆液及BALF中MPO水平检测 取“2.3.3”“2.3.4”项下小鼠肺组织匀浆液及BALF，按照相关检测试剂盒说明书操作检测MPO水平。

2.3.6 BALF中IL-1β水平检测 取“2.3.3”项下小鼠BALF，按照相关检测试剂盒说明书操作检测IL-1β水平。

2.4 HE染色检测小鼠肺组织病理变化 取小鼠左肺上叶组织，放入装有4%多聚甲醛的离心管中固定24 h，送至江苏省药物安全性评价中心病理室包埋切片，HE染色，并进行单盲病变评分。根据病变由轻到重的程度，依次定量为0分，正常；0.5分，轻微或极少量；1分，轻度或少量；2分，中度或较多；3分，重度或多量；4分，极重度或大量，累加分数，计算平均值，分值越高，损伤程度越严重。

3 结果

3.1 清宣止咳颗粒对氨水引咳小鼠的镇咳作用

3.1.1 咳嗽次数、咳嗽潜伏期 空白组小鼠由于无刺激源未见显著咳嗽反应，故咳嗽次数记为0，咳嗽潜伏期记为300 s。如图1所示，与空白组比较，模型组小鼠咳嗽次数增加，咳嗽潜伏期缩短(P<0.01)；清宣止咳颗粒1、2.5、5 g/kg组能减少300 s内的咳嗽次数，使咳嗽潜伏期延长(P<0.01)。

3.1.2 HE染色、病理评分 如图2所示，与模型组比较，清宣止咳颗粒干预后能有效减少小鼠肺部充血、炎细胞浸润等病变(P<0.01)。

注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。图2 氨水引咳模型中各组小鼠肺组织HE染色(A)和病理评分Fig.2 HE staining (A) and pathological scores (B) for lung tissues of mice in ammonia-induced cough model

3.2 清宣止咳颗粒对气管泌红小鼠的祛痰作用 如图3所示，与模型组比较，清宣止咳颗粒干预后能剂量依赖性地增加小鼠气管内酚红的排泌量，剂量为5 g/kg时效果最好(P<0.05)。

注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。图3 各组小鼠气管内酚红排泌量Fig.3 Tracheal excretions of phenol red of mice in each

3.3 清宣止咳颗粒对脂多糖气管滴注诱导急性肺损伤小鼠的影响

3.3.1 HE染色、病理评分 如图4所示，脂多糖气管滴注24 h后，与空白组比较，脂多糖组小鼠肺组织出现大范围的病变，表现为肺泡壁轻度或中度充血、出血，肺泡壁有中性粒细胞和单核巨噬细胞等炎细胞浸润，肺泡壁出现肺气肿，肺泡腔增大，肺内支气管上皮细胞出现变性等病变(P<0.01)；与脂多糖组比较，清宣止咳颗粒给药后能减轻小鼠肺部充血、炎细胞浸润等病变(P<0.01)。

3.3.2 BALF和肺组织中MPO活性、IL-1β水平 如图5所示，与脂多糖组比较，清宣止咳颗粒各剂量组小鼠BALF和肺组织中MPO活性降低(P<0.05，P<0.01)，BALF中IL-1β水平降低(P<0.01)。

注：与空白组比较，##P<0.01；与脂多糖组比较，**P<0.01。图4 急性肺损伤模型中各组小鼠肺组织HE染色(A)和病理评分Fig.4 HE staining (A) and pathological scores (B) for lung tissues of mice in acute lung injury model

注：与空白组比较，##P<0.01；与脂多糖组比较，*P<0.05，**P<0.01。图5 各组小鼠BALF和肺组织中MPO活性(A、B)和BALF中IL-1β水平Fig.5 MPO activity (A, B) in BALF and lung tissues and IL-1β level (C) in BALF of mice in each

4 讨论

氨水是一种具有刺激性的化学物质，小鼠吸入氨水后即可引发咳嗽。本研究显示，剂量为1、2.5、5 g/kg的清宣止咳颗粒单次灌胃给药后，都能有效减少5 min内的咳嗽次数，延长咳嗽潜伏期，5 g/kg剂量效果显著。本研究还考察了药物对氨水引起的急性肺部损伤的保护作用，病理结果表明，清宣止咳颗粒能有效减少小鼠肺部充血、炎细胞浸润等病变。提示清宣止咳颗粒具有良好的镇咳、祛痰作用，与其临床常用于治疗小儿外感风寒咳嗽应用相一致。

大多数祛痰药物都能增加呼吸道分泌物，稀释呼吸道痰液，使其容易随纤毛运动通过咳嗽发射咳出[16]。在本实验中，通过检测气管内酚红的排泌量，来考察清宣止咳颗粒对痰液分泌的影响。实验结果表明，当连续多次给药后，5 g/kg清宣止咳颗粒能增加气管内酚红排泌量。提示，清宣止咳颗粒多次给药有较好祛痰效果。感染和组织损伤是炎症发生的主要诱因，先天免疫系统细胞如中性粒细胞和巨噬细胞的浸润是急性炎症的特征，目前脂多糖气管滴注是研究肺部感染引起急性肺损伤的主要模型[17]。本研究使用脂多糖气管滴注成功地复制了急性肺损伤模型，研究结果显示给予清宣止咳颗粒能够显著改善急性肺损伤模型中小鼠肺泡壁充血，嗜中性粒细胞和单核巨噬细胞等炎细胞浸润，肺内支气管上皮细胞变性，肺泡腔增大，局部肺泡壁破坏、融合等病变。已有报道表明，清宣止咳颗粒可通过抑制咳嗽模型大鼠腹主动脉炎症因子IL-4、IL-8及TNF-α水平，从而抑制气道炎症与高反应[17]。清宣止咳颗粒还可降低咳嗽模型大鼠血清中IgE、LTC-4水平，升高IFN-γ水平，调节机体免疫功能紊乱，抑制或阻断气道慢性炎症反应[18]。

重症咳嗽患者的肺泡灌洗液、肺泡组织中存在活化的中性粒细胞增多与浸润，可分泌MPO、白介素等炎症反应标志物。本研究进一步证明清宣止咳颗粒能够抑制脂多糖诱导急性肺损伤模型小鼠BALF和肺组织中MPO活性的增加，并减少BALF中IL-1β水平。MPO作为中性粒细胞活化的自分泌调节剂，长期以来被认为与组织损伤有关，清宣止咳颗粒给药组咳嗽大鼠的MPO活性降低表明清宣止咳颗粒可能抑制炎症细胞的浸润从而减轻肺组织损伤[18]。脂多糖通过Toll样受体4诱导促炎细胞因子如TNF-α的快速释放，激活多种下游效应因子如IL-1β和IL-6的产生，从而放大炎症反应，清宣止咳颗粒给药组大鼠BALF中IL-1β水平的减少可反映清宣止咳颗粒的抗炎作用[8]。由此可知，清宣止咳颗粒通过抑制MPO活性和IL-1β水平缓解急性炎症，这可能是清宣止咳颗粒治疗咳嗽的重要作用机制。

综上所述，清宣止咳颗粒能够抑制氨水引起的小鼠急性咳嗽，促进酚红排泌，其治疗咳嗽、祛痰、抗炎的机制可能是通过抑制急性肺损伤大鼠炎症因子的释放，减轻炎症反应。