化瘀通络中药对糖尿病肾病大鼠氧化应激和炎症的干预作用及其机制研究

李雅纯， 方 敬， 郭 帅， 杨 帆， 陈志强,2*

(1.河北中医学院，河北 石家庄 050091；2.河北省中医院，河北 石家庄 050011)

国际糖尿病联合会公布的数据显示，2019年全球成人糖尿病患者超过4.63亿，到2030年将增至5.78亿。而糖尿病肾病是糖尿病的微血管并发症，也是其最主要的慢性并发症之一，影响着40%以上的糖尿病患者，在大多数国家已经成为导致终末期肾病的主要原因[1]。目前尚缺乏针对糖尿病肾病的特效药物，而中医药对其防治有着巨大潜力。基于中医病机理论结合多年临床实践，本课题组认为瘀血阻络证贯穿糖尿病肾病病程始终，且此观点已经成为业界的共识[2-5]。据证立法，化瘀通络中药因此成为临床防治糖尿病肾病复方的必要组成部分。并且前期研究证实陈志强教授经验方—益气养阴消癥通络方加减可明显改善糖尿病肾病各期患者的临床症状，降低血糖血脂并减少尿蛋白排泄[6-7]。为了明确具有不同功效的中药治疗靶点的差异性及其作用机制，选取陈志强教授临床应用频率最高的五味化瘀通络中药进行深入研究。

大量研究表明，高血糖诱导的氧化应激和炎症在糖尿病肾病的进程中起着关键性的作用[8]，并且氧化应激与炎症可以相互作用进行正反馈调节，从而加重肾脏损伤[9]。近年来核转录因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)信号通路在糖尿病肾病中的作用受到广泛关注，动物实验表明，Nrf2基因敲除可导致自身免疫性狼疮性肾炎，并加重糖尿病引起的炎症、氧化应激和肾损伤[10-11]。因此，Nrf2信号通路对于氧化应激和炎症介导的肾损伤具有保护作用。故本研究以链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠为载体，探讨化瘀通络中药对氧化应激和炎症的干预作用及对肾脏Nrf2信号通路的影响，以期发现化瘀通络中药保护肾功能，改善肾损伤的可能作用靶点。

1 材料与方法

1.1 药物 中药配方颗粒，丹参(批号8080971)、川芎(批号8122561)、水蛭(批号8081351)、全蝎(批号8050111)、地龙(批号7125701)，均由广东一方制药有限公司惠赠；厄贝沙坦分散片(150 mg/片，华润双鹤利民药业有限公司，批号1904238)。

1.2 动物 由北京维通利华实验动物技术有限公司提供SPF级雄性SD大鼠，体质量60～80 g，动物生产许可证号SCXK(京)2016-0006。

1.3 试剂 链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(瑞士Alexis公司，批号07171414)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号A003-1-2、A001-3-2)；大鼠TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒(上海森雄科技实业有限公司，批号SXR063、SXR026)；冻存样本核蛋白提取试剂盒(上海贝博生物科技有限公司，批号BB-3166)；小鼠单克隆抗体Nrf2(英国Abcam公司，批号ab89443)；小鼠单克隆抗体HO-1、小鼠单克隆抗体Keap1(美国Santa Cruz公司，批号sc-390991、sc-514914)；兔单克隆抗体Histone H3(Abways公司，批号CY6587)。

1.4 仪器 NanoDrop 2000C 紫外分光光度计(美国Thermo公司)；BX63+DP72正置研究级显微镜、IX71荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)；酶标仪(美国Molecular Devices公司)；红外激光扫描仪(美国Odyssey公司)；全自动生化分析仪(日本Hitachi公司)。

1.5 实验方法

1.5.1 模型建立和分组 40只大鼠普通饲料适应性喂养1周，检测血糖和尿蛋白均为阴性。随机选取7只作为正常对照组，予以普通饲料喂养。其余大鼠为造模组，用高糖高脂饲料喂养6周后，禁食不禁水12 h。以35 mg/kg给药标准计算出每只大鼠所需STZ药量，采用一次性腹腔注射法注射1% STZ溶液，72 h后3次尾静脉取血检测大鼠随机血糖(random blood glucose，RBG)均≥16.7 mmol/L者即为糖尿病模型复制成功。2只大鼠不符合成模标准予以剔除，3只造模后死亡。随后将成模大鼠随机分为模型组10只、化瘀通络中药组9只和厄贝沙坦组9只。

1.5.2 给药方法 化瘀通络中药由川芎、丹参、地龙、水蛭和全蝎组成。70 kg成人临床一般常用配伍药量为川芎12 g、丹参15 g、地龙10 g、水蛭6 g、全蝎6 g。根据此药量，按照《中药药理研究方法学》换算出大鼠每天所需灌胃量，计算结果为川芎1.08 g/kg、丹参1.35 g/kg、地龙0.9 g/kg、水蛭0.54 g/kg、全蝎0.54 g/kg和厄贝沙坦13.5 mg/kg。正常组和模型组给予同容量纯净水灌胃。每天1次，连续灌胃16周。

1.5.3 24 h尿蛋白定量(24 h urine protein quantitation，24 h UTP)检测 于16周末将大鼠置于代谢笼收集24 h总尿量，混匀后留取1 mL尿液离心取上清液，终点法检测尿蛋白量。

1.5.4 血液指标检测 10%水合氯醛300 mg/kg麻醉大鼠，剖腹，腹主动脉取血，全自动生化分析仪检测肾功能；按照ELISA试剂盒说明书操作检测血浆炎症因子TNF-α和IL-1β水平；按照SOD和MDA试剂盒说明书操作检测血浆SOD活性和MDA水平。

1.5.5 观察肾脏病理变化 将肾组织在FAA固定液中充分固定24 h，流水冲洗12 h，按常规乙醇梯度脱水(70%、80%、90%、95%、100%)，二甲苯透明，浸蜡包埋。切片机切成约2 μm薄片，行HE和Masson染色，在光镜下观察，并使用Image-Pro Plus 6.0分析软件对Masson染色进行分析，计算出胶原面积占比。

1.5.6 免疫荧光检测肾组织Nrf2核转移 切片常规脱蜡至水，高压修复，冷却至室温，自来水冲洗，加入3%双氧水，PBS浸泡，并用5% BSA孵育30 min，滴加Nrf2一抗工作液(1∶100)，4 ℃过夜；PBS清洗后，滴加荧光二抗(1∶50)，37 ℃孵育；PBS清洗，滴加DAPI室温孵育10 min，自来水冲洗，封片，荧光显微镜观察。

1.5.7 Western blot法检测Nrf2通路相关蛋白表达 提取肾皮质总蛋白(检测Nrf2蛋白细胞核表达时使用核质分离试剂盒提取肾皮质的核蛋白)，BCA法检测各样品蛋白浓度并按比例稀释，100 ℃水浴5 min。制胶，上样，120 V电泳2 h，干转30 min至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，4 ℃分别孵育Nrf2(1∶1 000)、Keap1(1∶400)和HO-1(1∶400)过夜。洗膜后孵育相应的二抗1 h，ECL化学发光法显影。目的蛋白相对表达量以目的条带灰度值与β-actin或Histone H3灰度值的比值表示。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况及随机血糖 正常对照组大鼠精神状态良好，活动灵活，毛色有光泽；模型组大鼠精神萎靡，反应迟钝，毛色晦暗无光，实验过程中死亡3只；两治疗组大鼠一般情况较模型组有所改善，实验过程中两组大鼠各死亡2只。模型组及两治疗组RBG均较正常对照组升高(P<0.01)，但三组间大鼠RBG比较无明显变化(P>0.05)。见表1。

2.2 24 h尿蛋白定量与肾功能 与正常对照组比较，模型组大鼠24 h UTP和血肌酐(serum creatinine，Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平升高(P<0.01)；与模型组比较，化瘀通络中药组和厄贝沙坦组大鼠24 h UTP和Scr、BUN水平均降低(P<0.05，P<0.01)；两治疗组间比较无明显变化(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血糖、24 h尿蛋白定量和肾功能比较

2.3 肾脏形态学观察 正常对照组大鼠肾脏结构正常；模型组大鼠出现肾小球肥大，囊腔狭窄，部分肾小球甚至出现球囊粘连，并且肾小球基底膜(glomerular basemrnt membrane，GBM)明显增厚，系膜细胞重度增生同时伴有细胞外基质(extracellular matrix，ECM)明显增生；化瘀通络中药组和厄贝沙坦组大鼠肾脏病理得到明显改善。Masson染色分析结果显示，模型组较正常对照组胶原面积占比增加(P<0.01)；化瘀通络中药组和厄贝沙坦组较模型组胶原面积减少(P<0.01)，两治疗组间比较无明显变化(P>0.05)。见图1。

注：A为各组大鼠肾组织HE染色和Masson染色(×400)，B为各组大鼠肾组织胶原面积占比。与正常对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，☆☆P<0.01。图1 各组大鼠肾脏结构和胶原面积比较

2.4 氧化应激相关指标 与正常对照组比较，模型组大鼠MDA水平升高，SOD活性降低(P<0.01)；与模型组比较，化瘀通络中药组MDA水平降低(P<0.05)，厄贝沙坦组则无明显变化(P>0.05)；与模型组比较，两治疗组SOD活性均升高(P<0.05，P<0.01)，且两治疗组间比较无明显变化(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血浆SOD活性和MDA水平比较

2.5 炎症因子水平 与正常对照组比较，模型组大鼠TNF-α和IL-1β水平升高(P<0.01)；与模型组比较，化瘀通络中药组TNF-α水平降低(P<0.05)，厄贝沙坦组则无明显变化(P>0.05)；与模型组比较，化瘀通络中药组和厄贝沙坦组IL-1β水平均降低(P<0.05)，且两治疗组间比较无明显变化(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血浆促炎因子水平比较

2.6 Nrf2信号通路相关蛋白表达 与正常对照组比较，模型组大鼠肾皮质Nrf2核转移减少，Keap-1表达增加，HO-1表达降低(P<0.01)；与模型组比较，化瘀通络中药组Nrf2核转移增加，Keap-1表达减少，HO-1表达升高(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，厄贝沙坦组Keap-1表达减少(P<0.01)，其余蛋白表达无明显变化(P>0.05)；与厄贝沙坦组比较，化瘀通络中药组Keap-1表达无明显变化(P>0.05)。免疫荧光结果显示，模型组较正常对照组Nrf2核转移减少；化瘀通络中药组较模型组Nrf2核转移增加；厄贝沙坦组与模型组比较Nrf2核转移增加不明显，与Western blot检测结果基本一致。见图2。

注：A为Western blot检测各组大鼠肾皮质中核Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表达，B为免疫荧光检测各组大鼠肾皮质中Nrf2蛋白表达(×200)。与正常对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01。图2 各组大鼠肾皮质中核Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表达

3 讨论

糖尿病肾病作为糖尿病严重的微血管并发症，临床表现以大量蛋白尿为主，病理表现以ECM过度堆积为其主要特征[12]。本研究中采用高糖高脂饲料联合一次性小剂量注射STZ来复制糖尿病肾病大鼠模型，实验结果显示模型组大鼠较正常组血糖升高，肾功能受损，并出现大量蛋白尿，肾脏病理表现出GBM明显增厚，ECM大量积聚，说明糖尿病肾病大鼠模型复制成功。给予化瘀通络中药治疗后，糖尿病肾病大鼠Scr降低，尿蛋白减少，肾脏病理得到明显改善，与本课题组前期研究一致[13]，表示化瘀通络中药可以改善糖尿病肾病的临床症状，保护肾功能，延缓肾损害。

在糖尿病肾病的诸多发病机制中，氧化应激与炎症起着关键作用。研究表明，由于ROS产生过多引起的肾脏氧化应激是导致ECM增生的主要原因之一[14]。并且氧化应激可以诱导炎症因子的产生，细胞炎症因子的增加又可以刺激自由基的产生，进一步加重机体氧化应激反应，从而建立一个恶性循环[15]。MDA为脂质过氧化的最终分解产物；SOD是对抗氧化应激的酶促防御系统的重要成分，对机体抗氧化反应起着至关重要的作用[16]。二者常被联合检测，用来反映氧化应激的程度。实验结果显示化瘀通络中药治疗后的糖尿病肾病大鼠，较模型组MDA水平下降，SOD活性升高，提示在糖尿病肾病的进程中，化瘀通络中药具有抑制氧化应激的作用。研究表明炎症因子TNF-α和IL-1β水平均与STZ诱导的糖尿病肾病大鼠的尿蛋白排泄有关[17-18]。因此，为了解糖尿病肾病大鼠体内的炎症水平，本研究对血浆促炎因子TNF-α和IL-1β水平进行了检测。本次实验结果显示化瘀通络中药组大鼠较模型组TNF-α和IL-1β水平降低，表明化瘀通络中药对炎症反应具有抑制作用。

近年来，Nrf2信号通路在糖尿病肾病中的抗氧化和抗炎作用受到广泛关注。STZ诱导的Nrf2基因敲除小鼠比野生型小鼠的氧化应激反应和肾损伤更严重[19]。且Nrf2敲除小鼠中促炎症因子表达增加，炎症反应较野生型小鼠更为强烈[20]。Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein，Keap1)被认为是Nrf2通路激活和抗氧化反应的一种抑制因子。正常状态下，Keap1与Nrf2结合形成一个复合结构，使Nrf2锚定在细胞质中，并使其泛素化，不断被降解。当机体发生氧化应激时，Nrf2-Keap1连接被打破，Nrf2被释放进入细胞核内与下游靶基因启动子的抗氧化应答元件(antioxidant response element，ARE)结合，中和自由基并加快细胞毒素清除[21]。血红素加氧酶(heme oxygenase-1，HO-1)是Nrf2重要的靶基因，它的启动子序列包含两个增强子区域(E1和E2)，Nrf2则通过E1和E2区域的ARE序列对HO-1蛋白表达进行调控。HO-1是一种限速酶，可以催化血红素降解为一些具有抗氧化作用的副产物，如胆绿素、一氧化碳和Fe2+。研究表明这些副产物对受到氧化应激[22]和炎症[23]刺激的细胞具有保护作用。本研究结果显示，化瘀通络中药治疗可以降低Keap1的表达，增加Nrf2核转移，进而上调HO-1表达，表明Nrf2/HO-1信号通路可能是化瘀通络中药改善糖尿病肾病大鼠肾脏氧化应激与炎症反应的靶点之一。

糖尿病在中医归属于消渴的范畴，消渴的基本病机为气阴两虚，气能行血，血无气帅，则血行瘀滞；阴虚生内热，热灼津液，津血同源，津亏血少，脉道无以充养，则血行不畅，瘀滞更甚。因此，瘀血不仅作为一种病理产物，更是一个致病因素，引发糖尿病的一系列血管并发症。而糖尿病肾病作为其中一个严重微血管并发症，与瘀血的关系更为密切。叶天士指出“初为气结在经，久则血伤入络”。肾小球的毛细血管细长，回旋迂曲，与中医所述络脉特征类似。基于以上理论，本课题组提出瘀血阻络是贯穿糖尿病肾病始终的主体病机，且此观点已经成为业界的共识。因此，化瘀通络中药已经成为临床治疗糖尿病肾病的复方中一个必不可少的组成部分，且疗效可靠[24]。根据临床经验[25]及前期基础研究[26-27]，结合现代药理研究[28-30]，本实验选用草本药物丹参、川芎与虫类药物地龙、水蛭、全蝎共奏活血化瘀，消癥通络之功。

综上所述，化瘀通络中药治疗减少了糖尿病肾病大鼠的尿蛋白，其功效与厄贝沙坦相似。并且化瘀通络中药组大鼠Scr降低，肾脏病理得到明显改善；MDA水平下降，SOD活性升高；炎症因子TNF-α和IL-1β水平降低；Keap1表达减少，Nrf2核转移增加，HO-1表达上调。由此可见，化瘀通络中药可以改善糖尿病肾病的氧化应激和炎症反应，从而达到肾脏保护作用，而Nrf2/HO-1信号通路可能是其作用机制之一。