基于网络药理学和细胞实验探讨豆甾醇抗炎作用

吴力超， 李俊峰， 张婷婷， 陶方方， 刘文洪*

(1.浙江中医药大学基础医学院，浙江 杭州 310053；2.浙江中医药大学研究生院，浙江 杭州 310053)

炎症是一种常见的病理生理过程，在多种疾病的发生发展中具有重要作用，如阿尔兹海默症[1]、动脉粥样硬化[2]、系统性红斑狼疮[3]等。正常的炎症反应有利于机体清除“异己”，过度炎症反应可导致组织脏器功能障碍[4]。激素作为临床控制炎症的一线用药[5]，长期使用容易导致肾上腺皮质萎缩、无菌性股骨头坏死和向心性肥胖[6]等并发症。因此，开发具有低副作用的药物已成为临床迫切的需求。

研究表明，诸多中药具有良好的抗炎功效。雷公藤在系统性红斑狼疮[7]、类风湿性关节炎[8]中应用较多。赤芍在慢性牙周炎中也体现出较好的抗炎作用[9]。由于中药成分复杂，因此现代医学对于中药的研究多聚焦于中药活性成分的探讨。而豆甾醇作为雷公藤、赤芍等中药的主要活性成分，具有抗炎、抗病毒和抗肿瘤等多种生物活性[10-12]，已逐渐成为研究的热点。

网络药理学融合了生物信息学和药理学的方法，通过数据整合与计算分析，可系统性地阐明中药及化合物与诸多疾病的相互关系，探究药物作用机制[13]。因此，本研究拟采用网络药理学预测、细胞实验验证豆甾醇抗炎的作用靶点及可能机制，为抗炎药物的研发及临床应用提供一定理论支持。

1 材料

1.1 网络药理学数据库 TCMSP数据库(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)；PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；SwissTargetPrediction网站(http://www.swisstargetprediction.ch/)；Genecards数据库(https://www.genecards.org/)；OMIM数据库(https://omim.org/)；TTD数据库(http://db.idrblab.net/ttd/)；DrugBank数据库(https://go.drugbank.com/)；E Venn Diagram网站(http://www.ehbio.com/test/venn/)；STRING11.0数据库(https://string-db.org/)；PDB数据库(https://www.rcsb.org/)。

1.2 细胞 小鼠RAW264.7细胞购自上海吉凯基因化学技术有限公司。

1.3 试剂、药物与仪器 豆甾醇(批号B20314，上海源叶生物科技有限公司)。高糖DMEM培养基(批号11965092)、胎牛血清(批号12483020)、青链霉素(批号10378016)购自美国Gibco公司；脂多糖(LPS，货号L2880)、二甲基亚砜(DMSO，货号D2650)购自美国Sigma公司；CCK8试剂盒(货号BS350B)购自合肥白鲨生物科技有限公司；IL-10、IL-1β、TNF-α(货号MM-0176M1、MM-0039M2、MM-0132M1)购自武汉酶免生物科技有限公司；TRIzol® Plus RNA Purification Kit、SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis SuperMix、PowerSYBR® Green PCR Master Mix(货号12183-555、11752-050、4367659)购自美国Thermo Fisher Scientific公司；RIPA裂解液、SDS-PAGE胶试剂盒、脱脂奶粉、BCA蛋白试剂盒、彩色预染蛋白marker(货号P0013B、P0012A、P0216、P0012、P0075)购自上海碧云天生物技术有限公司；MAPK3兔单克隆抗体、PRKACA兔单克隆抗体、β-actin兔单克隆抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(货号ab32537、ab32390、ab8226、ab6721)购自英国Abcam公司。CFX384多重实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司；凝胶成像仪购自上海勤翔科学仪器有限公司。

2 方法

2.1 网络药理学方法

2.1.1 豆甾醇理化参数及潜在靶点获取 利用豆甾醇(stigmasterol)的CAS号83-48-7，从TCMSP数据库获取该化合物的特征信息及理化参数，并获取相应靶点；PubChem数据库获得豆甾醇的SDF文件，将SDF文件导入SwissTargetPrediction网站，进行靶点预测，获取豆甾醇的潜在靶点。2个数据库结果取并集。

2.1.2 炎症相关靶点收集 以“inflammation”为关键词输入到Genecards数据库，通过限定中位数，选取Relevance score>2.96的靶点；输入OMIM、TTD和DrugBank数据库，检索获得已验证的炎症相关靶点，4个数据库结果取并集。

2.1.3 药物与疾病共同靶点筛选及互作网络构建 使用Venn图在线网站对炎症靶点和豆甾醇靶点取交集，获取药物与疾病的共同靶点，绘制Venn图，交集基因即代表豆甾醇治疗炎症的潜在作用靶点。利用STRING11.0数据库构建共同靶点的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络，下载tsv文件，导入Cytoscape软件进行可视化。

2.1.4 核心靶点筛选 利用Cytoscape软件中的“Network Analyzer”插件分析PPI网络中各个靶点的Degree值，按照Degree值的大小排序，筛选出核心靶点(Degree值越大，说明网络中该靶点的重要性越强，筛选标准为大于Degree值中位数的2倍[14])。

2.1.5 GO和KEGG富集分析 利用R软件中的“clusterProfiler”包[15]对筛选出的核心靶点进行分析，包括基因本体(gene ontology, GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路分析，以P<0.05为标准，筛选出靶点参与的GO富集项目及KEGG通路信息。并用R软件对上述结果进行可视化分析。

2.1.6 分子对接 从PDB数据库获取MAPK3(ID:4QTB)和PRKACA(ID:4WB8)的pdb格式文件，使用Autodock对两个蛋白进行去水、加氢处理。在TCMSP数据库下载豆甾醇的mol2格式文件，利用Autodock Vina进行对接，计算结合能。使用Pymol2.4.2进行结果的可视化操作。

For the Figure 1a), the relationship of configuration formula derivation is shown as:

2.2 细胞实验方法

2.2.1 细胞培养 RAW264.7细胞培养于高糖DMEM培养液中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，于对数期进行传代备用。

2.2.2 CCK-8检测细胞存活率 取对数期细胞(1×104个/孔)接种于96孔板，培养24 h后，实验组加入含药培养液(质量浓度分别为1 000、500、250、125、62.5 μg/mL)；对照组加入等量0.5% DMSO；并设置不含细胞的空白组，每组设5个复孔。培养24 h后，加入CCK-8试剂，于37 ℃孵育4 h。于450 nm处，使用酶标仪测定光密度(OD)值。根据公式计算细胞存活率，摸索药物的最大无毒浓度(细胞存活80%以上)。细胞存活率=[(OD实验-OD空白)/(OD对照-OD空白)]×100%

2.2.3 细胞分组及干预 取对数生长期细胞，按照2×105/mL密度进行铺板，分为正常组、模型组、给药组(250、125、62.5 μg/mL)。除正常组外均用脂多糖(LPS)构建炎症模型，给药组预先加入不同质量浓度的豆甾醇干预1 h后，再加入LPS(1 μg/mL)。

2.2.4 ELISA检测细胞IL-10、IL-1β、TNF-α水平 细胞按照“2.2.3”项下分组方法进行分组，给药干预24 h，取细胞培养上清液，离心后按照ELISA试剂盒说明书操作进行检测。

2.2.5 RT-qPCR检测细胞中MAPK3、PRKACAmRNA的表达 细胞按照“2.2.3”项下分组方法进行分组，给药干预24 h，弃去培养上清，PBS清洗2次。用Trizol试剂提取细胞总RNA，在试剂盒说明书操作下，将RNA逆转录生成cDNA(25 ℃，10 min；50 ℃，30 min；85 ℃，5 min)，并进行RT-qPCR分析(95 ℃，2 min；95 ℃，15 s；63 ℃，25 s；72 ℃，15 s；扩增40个循环)。使用β-actin作为内参，采用2-△△CT法进行分析。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司负责合成，引物序列见表1：

表1 引物序列

2.2.6 Western blot检测RAW264.7细胞中部分关键靶点蛋白的表达 细胞按照“2.2.3”项下分组进行给药，给药24 h后，弃去细胞上清液，每孔加RIPA细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂)100 μL，冰上充分裂解45 min，4 ℃、12 000×g离心15 min，弃去沉淀，收集上清液，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度，10% SDS-PAGE胶电泳分离蛋白，湿法转膜120 min。转膜结束后，TBST漂洗3次，每次5 min，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗MAPK3(1∶1 000)、PRKACA(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。弃去一抗后，TBST漂洗3次，每次5 min，加入二抗(1∶1 000)，室温25 ℃孵育2 h。最后ECL化学发光显影，采集图像并使用Image J分析灰度值。

3 结果

3.1 豆甾醇的理化性质 从TCMSP数据库中获取豆甾醇的理化性质及药理分子性质数据，类药性(drug likeness, DL)可以用于评估一种成分开发成药物的可能性，口服利用度(oral bioavailability, OB)则用于评价成分吸收进入血液发挥作用的难易程度。结果显示，OB≥30%，DL≥0.18，表明豆甾醇吸收度好，开发成药物的可能性较高(表2)。

表2 豆甾醇药理分子性质

图1 豆甾醇目标靶点

3.3 共同靶点获取及PPI网络构建 Venn图结果表明，通过匹配129个药物靶点和2 945个疾病靶点，筛选出88个共同靶点(图2A)，这88个共同靶点是豆甾醇抗炎的潜在靶点。将88个靶点导入STRING数据库，得到PPI网络，PPI网络中有88个靶点(Node)和373条边(Edge)。“Network Analyzer”插件可以用于分析靶点的贡献度(Degree)值，利用分析后的拓扑参数结果来对PPI网络进行可视化，形状越大，颜色越深，表明该节点的Degree值越大(图2B)。

图2 豆甾醇抗炎的潜在靶点Venn图(A)和蛋白互作网络图(B)

3.4 核心靶点分析结果 将“3.2”项中分析得到的Degree值导出后进行分析，Degree值中位数的2倍即14作为拓扑指标筛选核心靶点，分析后得到15个核心靶点，如MAPK3、PTGS2和PRKACA等(图3)。

图3 网络分析核心靶点

3.5 GO/KEGG富集分析结果 将上述15个核心靶点导入R软件，使用R软件中“clusterProfiler”包对核心靶点进行富集分析，将15个靶点的基因名转换为Entrez ID(表3)，进行后续富集分析。

表3 基因名及对应的Entrez ID

GO富集分析结果显示，具有生物学过程(biological process, BP)695条，细胞成分(cellular component, CC)13条，分子功能(molecular function, MF)46条，根据GeneRatio值大小各筛选出前10条展示。由图4可知，BP主要涉及对类固醇激素的反应(response to steroid hormone)、对营养水平的反应(response to nutrient levels)、生殖系统发育(reproductive system development)等；CC主要涉及膜筏(membrane raft)、核斑点(nuclear speck)等；MF主要涉及核受体活性(nuclear receptor activity)、类固醇激素受体活性(steroid hormone receptor activity)、酰胺结合(peptide binding)等。

KEGG通路分析结果表明，豆甾醇治疗炎症的靶点主要富集在39条信号通路上(P<0.05)。根据GeneRatio值大小筛选出前20条KEGG通路，并利用R软件绘制气泡图(图5)。主要涉及雌激素(estrogen signaling pathway)、内分泌抵抗(endocrine resistance)、甲状腺激素等信号通路(thyroid hormone signaling pathway)，表明豆甾醇可能通过雌激素、内分泌抵抗和甲状腺激素等信号通路发挥抗炎作用。KEGG结果显示雌激素信号通路GeneRatio值最高，富集靶点最多，说明该信号通路与豆甾醇抗炎作用较为密切，因此后续实验选择雌激素信号通路进行验证探讨。

图4 GO富集分析结果柱状图(前10)

图5 KEGG分析结果气泡图(前20)

3.6 分子对接结果 5个核心靶点中，Degree值前二的两个靶点为MAPK3与PRKACA，分别为36与18。使用Autodock Vina软件对豆甾醇及MAPK3与PRKACA蛋白进行对接，获得结合能。结果显示豆甾醇与MAPK3的结合能为-7.4 kcal/mol，与PRKACA的结合能为-7.5 kcal/mol。Pymol可视化结果发现，豆甾醇与MAPK3的ARG-96残基相连(图6A)，与PRKACA的SER-259残基相连接(图6B)。

图6 分子对接结构图

3.7 豆甾醇对RAW264.7细胞活力的影响 不同质量浓度豆甾醇作用RAW264.7细胞24 h后，随着质量浓度的增加，细胞存活率逐渐降低，当给药质量浓度为250 μg/mL时，细胞存活率达到80%以上。因此，选择250 μg/mL为最大给药浓度(图7)。

图7 不同质量浓度的豆甾醇对细胞活力的影响

3.8 豆甾醇对RAW264.7细胞中细胞因子IL-10、IL-1β和TNF-α水平的影响 与正常组比较，模型组细胞中的IL-1β和TNF-α水平升高(P<0.01)，IL-10水平降低(P<0.05)；与模型组比较，豆甾醇给药组中IL-1β和TNF-α水平降低(P<0.05，P<0.01)(图8A～8B)，IL-10水平升高(P<0.05，P<0.01)(图8C)。药物干预后，2种细胞因子的变化均呈现剂量依赖性关系。

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。图8 RAW264.7细胞中IL-1β、TNF-α和IL-10的水平

3.9 豆甾醇对RAW264.7细胞中MAPK3、PRKACAmRNA表达的影响 与正常组比较，模型组细胞中MAPK3 mRNA表达升高(P<0.01)，PRKACAmRNA表达降低(P<0.05)；与模型组比较，62.5、125、250 μg/mL豆甾醇组细胞中MAPK3表达降低(P<0.05，P<0.01)，250 μg/mL豆甾醇组PRKACA表达升高(P<0.01)(图9)。

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。图9 RAW264.7细胞中PRKACA和MAPK3 mRNA表达

3.10 豆甾醇对RAW264.7细胞中MAPK3、PRKACA蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组细胞中MAPK3蛋白表达增加(P<0.05)，PRKACA蛋白表达降低(P<0.05)；与模型组比较，125、250 μg/mL豆甾醇组细胞中MAPK3蛋白表达降低(P<0.05，P<0.01)，62.5 μg/mL豆甾醇组无明显变化(P>0.05)，250 μg/mL豆甾醇组PRKACA表达升高(P<0.01)，62.5、125 μg/mL豆甾醇组PRKACA表达无明显变化(P>0.05)。蛋白表达与mRNA表达基本一致，表明豆甾醇可能通过下调MAPK3和上调PRKACA的表达，改善LPS诱导的炎症模型(图10)。

4 讨论

慢性持久的炎症反应可能会导致多种疾病，如肿瘤[16]、多器官功能障碍综合征[17]。据报道，重症新冠肺炎患者体内，炎症细胞因子水平IL-1β、TNF-α、CSF等增加，造成机体自身的免疫攻击，易引起患者死亡[18]。因此，控制过度的炎症反应对于机体的功能恢复至关重要。网络药理学通过数据库整合挖掘，结合实验验证能有效发现药物-疾病之间的新联系。

首先利用TCMSP数据库来获取豆甾醇的理化参数，评估药物的理化参数对于后续的分析至关重要。OB≥30%，DL≥0.18被广泛应用于筛选药物活性成分[19]。豆甾醇的理化参数表明其具有开发成有效药物的潜力；Venn图表明豆甾醇可能通过88个靶点作用于炎症。核心靶点的挖掘可以获取共同靶点中更为重要的靶点。Cytoscape发现88个靶点中，核心靶点包括MAPK3、PPARG和PRKACA等15个靶点。

KEGG分析显示雌激素信号通路与豆甾醇关系较为密切，同时该通路富集了5个核心靶点，包括MAPK3、PRKACA、PGR等。研究发现，补骨素能通过抑制雌激素信号通上的PGR、CTSD基因表达，降低炎症因子水平[20]。染料木素可以通过上调PRKACA的表达，降低血管内皮细胞的炎症反应[21]。氧化白藜芦醇可以抑制ERK1/2信号通路上的MAPK3来发挥抗炎作用[22]。因此，推测豆甾醇也可能通过干预雌激素信号通路发挥抗炎作用。分子对接显示，豆甾醇与MAPK3、PRKACA的对接结合能均较低。文献表明[23]，结合能小于-5 kcal/mol认为结合效果较好。结合能越低，表明配体与受体之间的相互结合力越强。分子对接表明豆甾醇能与MAPK3、PRKACA的活性基团以氢键相结合，从而抑制目标蛋白的活性。

当巨噬细胞受到LPS刺激后，会产生大量炎症因子，包括IL-1β、TNF-α、IL-6等，而IL-10作为淋巴细胞分泌的抗炎因子，可以抑制炎症因子分泌，减轻炎症反应[24]。ELISA结果显示，豆甾醇能有效抑制炎症模型中炎症因子IL-1β和TNF-α的水平，并且升高抗炎因子IL-10水平，初步表明豆甾醇具有抗炎功效，与先前研究一致[25]。在RT-qPCR与Western blot实验中，LPS作用于RAW264.7细胞后，MAPK3表达升高，PRKACA表达降低；经过豆甾醇干预后，MAPK3表达降低，PRKACA表达升高。MAPK3参与细胞的增殖、分化与凋亡，经过LPS刺激后，MAPK3激活下游细胞因子参与炎症反应[26]。PRKACA是第二信使cAMP下游分子，活化的cAMP/PRKACA通路可以抑制炎症反应[27]。因此，豆甾醇可能通过调节雌激素信号通路上MAPK3和PRKACA两个核心靶点的表达，调控细胞因子水平，从而发挥抗炎作用。该实验结果进一步证实了网络药理学预测的准确性和可靠性。