基于网络药理学和分子对接研究平贝母中生物碱的抗炎作用

金 鑫， 吕经纬， 边学峰， 杨小倩， 张 辉*

(长春中医药大学，吉林省人参科学研究院，吉林 长春 130117)

炎症是机体对致病因素及其损害作用产生的一种反应[1]，能导致细胞变性、坏死，代谢功能的异常。目前，临床上常使用抗菌药和抗病毒药进行治疗，但这类药物长期使用容易产生耐药性[2]。因此，迫切需要筛选出新的抗炎药。

平贝母FritillariaeussuriensisBulbus为百合科植物平贝母FritillariaussuriensisMaxim的干燥鳞茎[3]，主要用于清热润肺、化痰止咳[4]。研究还发现平贝母具有抗炎[5]、抗高血压[6]、抗溃疡[7]、抗平滑肌收缩[8]、抗氧化[9]、抗癌等作用。生物碱为平贝母主要有效成分之一，具有良好生物活性[10]，但由于平贝母中生物碱的种类复杂，通过传统的实验方法来准确阐明治疗疾病的作用机制存在困难[11]。因此，有必要寻找一种创新的方法来解释特定成分与分子作用机制之间的关系。

网络药理学是以系统生物学和计算机技术为指导的新兴技术，通过网络药理学分析还可以提高药物的治疗效果，减少不良反应，从而提高新药临床试验的成功率，大大节约药物开发成本[12]。分子对接主要研究分子(如蛋白和药物)之间相互作用，能够预测其结合方式，计算出复合物的亲和力，通过分子对接技术可以确定配体和受体的相对位置和取向，进而研究出激动剂、抑制剂或药物作用的机制，为新药的设计奠定了基础[13]。

本研究采用网络药理学和分子对接结合的方法，探究平贝母抗炎作用可能的作用靶点和作用通路，为进一步的研究和开发提供参考。

1 材料和方法

1.1 平贝母化学成分和作用靶点的筛选 通过中药系统药理学数据库和分析平台[14](TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php/)筛选出平贝母生物碱类化学成分，并使用UniProt KB[15](https://www.uniprot.org/)数据库，筛选出平贝母生物碱类成分所定对应的人的作用靶点，构建出一个关于化合物和靶点之间的关系图。

1.2 炎症潜在靶点基因的筛选 为了获得抗炎的相关基因，搜索了两个疾病基因数据库，分别为GeneCards[16](https://www.genecards.org/)、OMIM[17](https://omim.org/)。然后，对搜索靶点进行整合处理，删除重复靶点得到了炎症疾病相关的治疗靶点。

1.3 化合物-疾病-靶点网络图和蛋白质-蛋白质网络的构建

Cytoscape是一款可以集成任何类型的属性数据，形成可视化复杂网络图的软件[18]，将化合物-靶点和疾病-靶点的相关数据输入Cytoscape(http://www.cytoscape.org/)进行整合，生成平贝母生物碱-抗炎-靶点的网络关系图。String数据库(http://string-db.org)主要用来评估与整合蛋白质的相互作用，包括蛋白质与蛋白质的直接(物理)和间接(化学)关系[19]，利用String数据库，可以直接将靶点转化为蛋白质，构建出蛋白质-蛋白质相互作用关系图(PPI),并筛选了前28名PPI网络核心基因，构建柱形图。

1.4 GO富集分析和KEGG富集分析的构建 ClusterProfiler是Bioconductor的一个软件包，可以对基因的功能进行聚类的统计及可视化分析。通过R(Bioconductor)语言进行GO和KEGG富集分析。根据统计学意义P<0.05，筛选出平贝母生物碱抗炎作用可能的作用靶点(GO分析)和作用通路(KEGG分析)，并绘制柱形图。P值越小表示该信号通路的可信度越高。

1.5 分子对接分析 通过ChemOffice将活性化合物的2D结构转换为3D结构。使用Uniprot[20](https://www.uniprot.org/)查找活性靶点对应的人体蛋白编码。然后，从PDB(https://www.rcsb.org/)数据库下载蛋白的三维结构，并使用PyMOL[21]软件(http://tcmspw.com/tcmsp.php/)去除水分子和去除自由基，加氢。最后，采用AutoDock vina 4.2将化合物和蛋白分子的格式转换为pdbqt格式，进行分子对接，计算分子结合能。一般认为结合能越低，配体和受体结合性越好。

2 结果

2.1 化合物和靶标的对应筛选结果 从TCMSP数据库中，共筛选出得到14种生物碱类成分，并通过UniProt KB数据库找出成分所对应的潜在靶点。最后，得到14种生物碱类活性成分对应的潜在靶点(表1)。OB为口服生物利用度，是评价药物吸收程度的指标。DL表示类药物，表示化合物与现有药物的相似性。结果显示，平贝七环碱(ussuriendine)、贝母辛(peimisine)、胸腺嘧啶(thy)和贝母乙素(verticinone)具有较高的口服生物利用度。科迪林(cordiline)、β-倍半水芹烯{(3S)-3-[(1R)-1,5-dimethylhex-4-enyl]-6-methylenecyclohexene}、茄啶(solatubin)、去氢鄂贝定碱(ebeiedinone)、贝母乙素(verticinone)和西贝母碱(imperialine)具有较高的类药性。

表1 平贝母生物碱类成分及其对应靶点

2.2 疾病靶点筛选结果 从GeneCards、OMIM等疾病数据库中，筛选关于抗炎的相关靶点，进行整合，删除重复的疾病靶点，共获得10 240个疾病靶点。

2.3 化合成分-疾病-靶点网络图和蛋白质-蛋白质网络构建结果 将化合物-靶点关系图与疾病-靶点关系图进行整合，筛选出共同的靶点，得到化合物-疾病-靶点相交的韦恩图。如图1所示，与抗炎作用的相关化合物共有13种，相关靶点32种，体现了中药成分多靶点的特点。将上述数据导入Cytoscape中，得到化合物-疾病-靶点的可视化网络关系图(图2)。黄色代表靶点，蓝色代表成分，红色代表疾病。结果显示，verticinone的节点数最多，peimisine和peimine次之。将32个靶点输入String数据库，得到蛋白互作网络关系图(图3)。如图4所示CASP3、IL-6、JUN、TNF、NR3C1、IL-1β、PPARG和NR3C1可能在平贝母抗炎作用过程中起关键性作用。

2.4 GO富集分析和KEGG富集分析结果 根据P值大小进行筛选靶点的生物过程。如图5所示，32个靶点的作用主要集中在调节细胞核受体活性、激活转录因子活性、调节G蛋白偶联的神经递质受体活性、调节乙酰胆碱受体活性和类固醇激素受体活性等方面。KEGG富集分析结果显示，核心靶点作用通路主要集中在C-型血凝素受体信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、NF-κB信号通路、MAPK信号通路等通路。图6为排名前20的通路。

2.5 分子对接结果 在Uniprot数据库中找到靶点对应的人体蛋白编码，并使用PDB数据库下载对应配体。采用AutoDock vina 4.2技术，将蛋白与化学成分进行分子对接，得到分子结合能。通常认为结合能越低亲和力越强，结合越稳定。一般认为分子结合能小于-4.25 kcal/mol，分子与靶点有一定的结合活性；小于-5.5 kcal/mol，分子与靶点有较好的结合活性；小于-8 kcal/mol，分子与靶点的结合具有强烈的活性。如表2所示，科迪林、平贝七环酮碱、平贝七环碱、贝母甲素、贝母辛、茄啶、去氢鄂贝定碱、西北母碱和贝母乙素与对应蛋白具有较低的结合能。其中，贝母甲素可能通过7KP9中SER-99位点和5I1B中GLN-38、VAL-41、LYS-63等位点(图7)；西贝母碱可能通过7KP9中TYR-115、GLU-116、PRO-100、SER-99和4O9H中THR-166、GLN-113等位点(图8)；贝母乙素可能通过与4O9H中GLY-59和PRO-46位点和5I1B中LYS-63等位点结合发挥抗炎活性(图9)。

图4 核心作用基因排名

表2 平贝母活性成分与蛋白分子对接结合能

图5 平贝母生物碱抗炎作用GO富集分析柱状图

图6 平贝母生物碱抗炎作用KEGG富集分析柱状图

图7 贝母甲素与5I1B(A)和7KP9(B)分子对接图

图8 西北母碱与7KP9(A)和4O9H(B)分子对接图

图9 贝母乙素与4O9H(A)和5I1B(B)分子对接图

3 讨论

基于网络药理学的方法，借助相关数据库和软件对平贝母生物碱的抗炎的作用机制进行了探讨。根据成分靶点筛选结果发现，平贝母中与抗炎作用相关的化学成分有13种，对应的靶点有32个，验证了中药多成分多靶点的特性。通过PPI蛋白网络关系显示，平贝母抗炎作用可能与CASP3、IL-6、JUN、TNF、NR3C1、IL-1β、PPARG和NR3C1等靶点有关。通过KEGG富集分析结果发现相关靶点主要集中在C-型血凝素受体信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、NF-κB信号通路、MAPK信号通路等通路。说明平贝母生物碱可能通过上述通路发挥抗炎作用。分子对接结果显示，平贝母生物碱与抗炎活性靶点的结合较低。

TNF信号通路可以参与全身炎症反应，是组成急性期反应的细胞因子之一。同时，TNF也可以触发激活许多途径，包括NF-κB和MAPK途径[22]。白介素-17(IL-17)是一个重要的促炎症细胞因子，由辅助性T细胞(Th17)及先天性免疫细胞等分泌，在多种炎性反应及自身免疫性疾病病理过程中发挥关键作用。IL-17受体(IL-17R)通过信号转导复合体IL-17R-Act1-TRAF6激活下游NF-κB、JNK等信号通路[23]。NF-κB信号通路在细胞因子诱导的基因表达中起关键性的调控作用，其调控的基因编码急性期反应蛋白、细胞因子、细胞粘附分子、免疫调节分子、病毒瘤基因、生长因子、转录和生长调控因子等。NF-κB参与免疫反应、炎症反应、细胞凋亡、肿瘤发生等多种生物进程[24]。上述通路均与炎症反应相关。

Du等[25]研究发现贝母乙素可以通过调节TNF-α、IL-1β和IL-6水平，并作用于NF-κB信号通路达到抗炎的作用。Lin等[26]研究发现西贝母碱通过NF-κB 通路达到抗炎和抗癌的作用。Xu等[27]研究发现贝母甲素对脂多糖引起的炎症有一定的抑制作用，可以降低TNF-α、IL-1β和IL-6水平，增加IL-10水平，作用于MAPKs和NF-κB通路。上述研究证明了本研究的准确性。本研究揭示了平贝母中生物碱的种类及抗炎作用的作用机制，并找到了多个潜在的作用靶点，为后续生物碱抗炎作用的靶点和通路研究奠定基础。