活性炭对半乳甘露低聚糖的脱色研究

黄曹兴，陶昱恒，廖吉丽，王欣妍，勇强

(南京林业大学化学工程学院，南京 210037)

田菁(Sesbaniacannabina)原产于低纬度热带和亚热带沿海地区，为灌木状草本植物，耐盐、耐涝，是优良的改良土壤绿肥植物[1-2]。田菁由种皮、胚乳、子叶等部分组成，胚乳的主要成分为半乳甘露聚糖，其相对分子质量约为100万Da[3]。

半乳甘露聚糖(GM)，是一种包含了甘露糖骨干与半乳糖支链的多糖，主要存在于豆科植物种子中，如田菁、胡芦巴、槐豆等植物[4-5]。田菁种子富含半乳甘露聚糖，目前多开发为纺织行业的浆料、石油开采辅料等，在食品中其也可作为安定剂和增黏剂使用。另外，半乳甘露聚糖可以通过物理法、酸法或酶法降解获得半乳甘露低聚糖，其中利用β-甘露聚糖酶降解的方法绿色、简便且得率高[6]。半乳甘露低聚糖(GMOS)作为功能性低聚糖家族的新成员，是由2～10个甘露糖基和半乳糖基连接而成的具有支链结构的低聚糖，是半乳甘露聚糖的不完全降解产物。半乳甘露低聚糖对双歧杆菌等肠道益生菌有明显的增殖作用[7]，且分子量越低，增殖效果越明显，并能产生大量的有机酸。田菁半乳甘露低聚糖可通过田菁种子酶解获得，但产品中含有大量色素，主要为美拉德色素(紫外下出现最大吸收峰的波长为420 nm[8])和酚类色素(紫外下出现最大吸收峰的波长为280 nm[9])。这些色素不仅影响半乳甘露低聚糖的感观性能，而且影响半乳甘露低聚糖的纯度以及生物活性。对此，可采用树脂吸附法、降解法和活性炭吸附等方法除去低聚糖中的色素。活性炭是一种孔隙丰富、比表面积大和吸附能力强的固体颗粒，可吸附液体中的小分子物质，从而达到分离和纯化液体中不同物质的目的。因此，本试验采用活性炭对半乳甘露低聚糖中的色素进行吸附，为了获得最佳的脱色效果分别进行了单因素试验和正交优化，为田菁半乳甘露低聚糖的精制技术提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

活性炭：选取上海久亿化学试剂有限公司的柱状活性炭、国药集团化学试剂有限公司的颗粒活性炭、溧阳市活性炭联合工厂的粉末活性炭。

田菁种子：购于江苏宿迁(将种子磨碎至粒径1.7 mm，水分为8.81%，半乳甘露聚糖质量分数为23.56%)。

β-甘露聚糖酶：由本实验室利用里氏木霉Rut C30以微晶纤维素为底物产酶获得。

1.2 试验方法

1.2.1 田菁种子酶解糖液的制备

按照聚糖含量40 g/L、β-甘露聚糖酶加量20 U/g的条件，将粉碎好的田菁种子在50 ℃、150 r/min 的条件下酶解72 h，酶解结束后取出，酶解糖液于10 000 r/min条件下离心5 min，保留上清液，将上清液灭活15 min，然后10 000 r/min离心5 min，将上清液置于-20 ℃冰箱备用。

1.2.2 活性炭的预处理

称取适量活性炭于烧杯中，倒入l%盐酸浸泡，浸泡12 h后，用热去离子水清洗，然后滤干，置于120 ℃下干燥8 h，冷却至室温备用[10]。

1.2.3 活性炭脱色

于250 mL锥形瓶中加入50 mL酶解糖液和一定量活性炭，塞紧橡皮塞，置于一定温度的恒温振荡水浴锅中，以150 r/min频率振荡。振荡结束后，脱色液经离心除去活性炭，置于4 ℃冰箱备用。

1.2.4 色素洗脱

取一定质量吸附色素后的湿炭放入三角瓶内，用自来水清洗两遍，每次清洗后均用离心机将炭和洗水分离，目的是除去水溶杂质，然后加入一定浓度、体积的丙酮，在一定温度下，用恒温振荡器摇动进行色素洗脱，一定时间后通过离心(4 000 r/min，15 min)分离活性炭，保留上清液[9]并浓缩，冷冻干燥成粉末。

1.2.5 红外光谱分析

取干燥后的色素及脱色前后的半乳甘露低聚糖产品1 mg，与100～200 mg经干燥的溴化钾粉末在玛瑙研钵中轻轻研磨均匀，经压片机压成薄片，用傅里叶变换红外光谱仪在4 000～400 cm-1区间内进行红外扫描[11]。

1.2.6 吸附等温线测定

将田菁种子酶解糖液分别稀释1，2，4，6，8，10，15和20倍，均加入等量活性炭，在一定温度下于恒温振荡水浴锅中以150 r/min振荡，结束后离心除去活性炭，测定脱色液的吸光度值，计算出平衡质量浓度Ce和每克活性炭吸附色素的量x/m[12]，再进行曲线拟合，得到吸附等温线。计算见公式(1)：

(1)

式中：x为被吸附色素的质量，g；m为活性炭的质量，g；v为所取半乳甘露低聚糖溶液的体积，L；C0为被吸附的色素质量浓度，g/L。

1.3 分析方法

1.3.1 色素吸光度值测定方法

将脱色后的酶解糖液经5 000 r/min离心后经0.45 μm的微孔滤膜过滤，采用岛津UV-1800型紫外可见分光光度计分别测定滤液在280和420 nm处的吸光度值。活性炭脱色效果的衡量，用色素脱除率和半乳甘露低聚糖回收率来表示，色值计算见公式(2)[13]：

(2)

式中：A为糖液的吸光度；b为比色皿的厚度，cm；c为糖液质量浓度，g/mL。

色素脱除率计算见公式(3)[13]：

(3)

1.3.2 半乳甘露低聚糖含量测定方法

经8 000 r/min离心反应液10 min取上清液，以超纯水稀释4 000倍，再经0.22 μm亲水性微滤膜过滤得滤液。采用Dionex ICS-5000高效阴离子交换色谱系统分析和定量检测反应液中的半乳甘露低聚糖含量[14]。色谱柱为CarboPacTM PA10(2 mm×50 mm)，保护柱为CarboPacTM PA10(2 mm×250 mm)。色谱条件：柱温30 ℃，采用四电位脉冲安培检测器(PAD)以外标法检测。

半乳甘露低聚糖回收率的计算见公式(4)：

半乳甘露低聚糖回收率=

(4)

2 结果与分析

2.1 活性炭脱色条件的优化

2.1.1 活性炭的种类对脱色效果的影响

活性炭的种类很多，按颗粒度大概可分为3种：柱状活性炭、颗粒活性炭和粉末活性炭。活性炭颗粒度不同，脱色效果也各有差异。为了选出最适合半乳甘露低聚糖溶液脱色的活性炭，对比了3种市售活性炭(柱状活性炭、颗粒活性炭和粉末活性炭)在吸附温度40 ℃、添加量为10%、吸附时间60 min的条件下对半乳甘露低聚糖溶液的脱色效果的影响，结果见表1。

表1 活性炭种类对色素脱除和半乳甘露低聚糖回收的影响Table 1 The effect of activated carbon type on pigment removal and galactomanno-oligosaccharide recovery %

由表1可知，柱状活性炭对酚类色素的吸附性能差，脱除率几近于零，颗粒活性炭的酚类色素脱除率为84.75%，粉末活性炭的酚类色素脱除率为95.35%；柱状活性炭对美拉德色素的选择性较差，脱除率仅在15%左右，颗粒活性炭及粉末活性炭的酚类色素脱除率分别为70.34%和71.12%。对半乳甘露低聚糖回收率而言，柱状活性炭最高，为99.05%，颗粒活性炭为93.46%，粉末活性炭为90.46%。

且从表1中可以看出，随着活性炭粒径的减小，单位质量活性炭的比表面积增大，吸附能力逐渐增大。但同时，随着粒径减小，活性炭难以从水中分离，使浊度增大，且半乳甘露低聚糖的回收率降低[15]。综合考量吸附能力和分离能力，选用颗粒活性炭进行下一步试验。

2.1.2 活性炭的添加量对脱色效果的影响

在温度40 ℃、吸附时间60 min条件下，考察颗粒活性炭添加量对田菁种子酶解糖液脱色效果的影响，结果见图1a。

由图1a可知，随着活性炭的增加，半乳甘露低聚糖回收率逐渐减少，而色素脱除率逐渐增加，活性炭添加量在9%～18%的范围内，色素脱除率缓慢增加，并逐渐趋于平稳，而半乳甘露低聚糖回收率迅速下降。这是因为随着活性炭用量增加，田菁种子酶解糖液中的色素颗粒几乎被去除而使色素脱除率增长缓慢；当色素脱除率趋于稳定时，多余的活性炭转而吸附半乳甘露低聚糖导致半乳甘露低聚糖损失明显地增大[16]，而且随着颗粒活性炭的增加，田菁种子酶解糖液的浊度增大，分离难度增加。综合比较田菁种子酶解糖液的脱色，活性炭固液分离难度和半乳甘露低聚糖的损失及经济可及性，确定颗粒活性炭添加量为9%，其对酚类色素和美拉德色素的脱除率分别为89.75%和73.37%，半乳甘露低聚糖回收率为92.21%。

2.1.3 吸附时间对脱色效果的影响

一般来说，吸附时间的延长有利于活性炭的脱色，但是吸附时间过长，活性炭上被吸附的色素可能会被解吸下来。本研究在吸附温度40 ℃、颗粒活性炭添加量9%的条件下，考察不同吸附时间对脱色效果的影响，结果见图1b。

由图1b可知，随着吸附时间增加，半乳甘露低聚糖回收率缓慢降低，色素脱除率缓慢增加，当吸附时间由30 min延长至40 min时，酚类色素的脱除率增加了2.18%，当吸附时间由70 min提升至80 min时，酚类色素的脱除率仅增加了0.8%，说明颗粒活性炭对于色素的吸附在脱色反应进行到80 min时达到吸附平衡[17]。因为色素与糖之间存在竞争性吸附关系[16]，且活性炭吸附属物理过程，是一种动态的吸附与解析的过程[18]，因此当吸附时间再延长时，色素颗粒可能会发生解析，而糖被吸附上去，导致色素脱除率降低和糖损失率升高。从田菁种子酶解糖液的色素脱除率和半乳甘露低聚糖的损失率方面考虑，确定吸附时间为60 min。

2.1.4 吸附温度对脱色效果的影响

由于温度与分子的运动有关，温度升高，分子运动加快，有利于吸附，因此温度在很大程度上会影响活性炭的脱色效果。本研究在颗粒活性炭添加量为9%、吸附时间为60 min的条件下，研究温度对脱色效果的影响，结果见1c。

由图1c可知，随着吸附温度的增加，半乳甘露低聚糖回收率逐渐降低，色素脱除率急剧增加，这是因为提高温度促使分子的热运动加快，分子间碰撞机会增加，有利于絮体的形成，也有利于加快吸附[19]。当吸附温度达到70 ℃以上时，酚类色素的脱除率呈现下降趋势，这是因为已经被吸附在活性炭上的色素重新被解吸下来，而同时活性炭对糖的亲和力增强，半乳甘露低聚糖损失率增加[16]。但是通过对吸附后溶液以及活性炭的脱附溶液中的糖组分进行离子色谱检测后发现，80 ℃的吸附温度并未对半乳甘露低聚糖的结构发生影响。该结果表明，半乳甘露低聚糖具有良好的热稳定性。综合色素脱除率及半乳甘露低聚糖回收率两个指标试验结果，确定吸附温度为40 ℃。

图1 3个因素对色素脱除率和半乳甘露低聚糖回收率的影响Fig. 1 Effect of the three infactors on pigment removal rate and galactomanno-oligosaccharides recovery

2.1.5 正交优化结果

影响田菁种子酶解糖液脱色效果的主要因素有活性炭添加量(A)、吸附温度(B)、吸附时间(C)。根据单因素试验结果，采用 L9 (33)正交试验来确定田菁种子酶解糖液颗粒活性炭脱色的最佳条件。因素水平设计见表2，不考虑因素的交互作用，以色素脱除率和半乳甘露低聚糖回收率作为衡量半乳甘露低聚糖产品的脱色精制效果的指标。试验结果及分析见表3，其中D=酚类色素脱除率+美拉德色素脱除率+半乳甘露低聚糖回收率。

由表3中比较3种因素的极差大小可知，吸附时间对脱色效果的影响最大，其次是吸附温度和活性炭添加量，同时可以确定颗粒活性炭脱色的最佳条件为活性炭添加量8%，吸附时间70 min，吸附温度45 ℃。在此条件下，酚类色素和美拉德色素的脱除率分别达到91.08%和66.52%，半乳甘露低聚糖回收率可保持在93.53%。

表2 正交试验因素水平Table 2 Orthogonal factors and levels

表3 正交试验数据及极差分析Table 3 Orthogonal experimental data and range analysis

2.2 红外光谱分析结果

将脱色前、脱色后的半乳甘露低聚糖和色素进行红外扫描，探究活性炭脱色对田菁种子酶解糖液中物质的影响，结果见图2。

图2 脱色前和脱色后的半乳甘露低聚糖以及色素的红外谱图Fig. 2 Infrared spectra of galactomanno-oligosaccharides and pigment before and after decoloration

由图2可知，经红外光谱鉴定，田菁种半乳甘露低聚糖的吸收谱带有如下特征吸收峰：1 612，1 024，870和813 cm-1处有较强的吸收峰。1 612 cm-1处为糖类的—OH吸收峰，1 024 cm-1处为糖环特征吸收峰，组成的单糖为吡喃环，813 cm-1处为α-1,6糖苷键的吸收峰[20]。通过比对脱色前和脱色后的半乳甘露低聚糖，可以发现各糖类吸收峰的峰位置没有发生明显改变，且没有出现新的吸收峰，说明活性炭吸附没有改变多糖的糖残基结构。

2.3 活性炭对色素的吸附等温线

采用正交优化的方案，将不同质量浓度的田菁种子酶解糖液进行活性炭吸附试验，以平衡质量浓度Ce为横坐标，每克活性炭吸附色素的量x/m为纵坐标，经过曲线拟合，发现颗粒活性炭对田菁种子中两种色素分子的吸附属于Langmuir等温模型，模型参数如表4所示，其中Qmax为饱和吸附容量，KL为Langmuir吸附常数，RL为通过KL值计算出的无量纲的分离因子常数，见公式(5)[23]：

(5)

式中：C为吸附前溶液中色素的最大质量浓度，即为初始质量浓度值C0，mg/L。

表4 吸附等温线模型参数Table 4 Parameters for adsorption isotherm model

由表4可知，颗粒活性炭对酚类色素和美拉德色素吸附能力不同，两者的饱和吸附容量分别为0.32 和0.57 g/g。通过比较分离因子常数RL值的大小，可以判断整个吸附反应进行的难易程度。一般认为：01 时，表示不可吸附[23]。两种色素的RL值均介于0和1之间，表明吸附反应容易进行，且酚类色素和美拉德色素的R值分别为0.99和0.98，表示相关系数较高。

3 结 论

半乳甘露低聚糖作为一种高生物活性的天然多糖降解产物，已经得到了越来越多的关注。本研究主要对半乳甘露低聚糖溶液的脱色精制进行了研究，结论如下：

1)在3种活性炭中，颗粒活性炭能在吸附少量的糖类的前提下，保留对色素较高的亲和力。同时，正交试验表明，吸附时间对脱色效果的影响最大，其次是吸附温度和活性炭添加量。在活性炭添加量为8%，吸附时间70 min，吸附温度45 ℃条件下，脱色效果最佳，酚类色素和美拉德色素的脱除率分别达到91.08%和66.52%，半乳甘露低聚糖回收率可保持在93.53%。

2)经红外光谱分析发现，活性炭可脱除大部分色素，如原花青素，同时没有改变多糖的糖残基结构。经曲线拟合发现颗粒活性炭对于田菁种子酶解糖液中色素的吸附属于Langmuir等温吸附，酚类色素和美拉德色素的饱和吸附容量分别为0.32 和0.57 g/g，且反应容易进行，相关系数较高。