一株结晶紫脱色菌的分离鉴定及脱色性能初步研究

杨云胧　牛秋红

摘 要：目的：分离和鉴定结晶紫脱色菌。方法：从采集水样中分离筛选到一株三苯甲烷类染料结晶紫降解菌WL7，通过培养、形态、生理生化及16S rDNA序列同源性比较进行鉴定，研究在不同接种量、培养温度、初始pH和培养时间下菌株WL7对结晶紫的脱色性能。结果：菌株WL7被鉴定为一株节杆菌（Arthrobacter rhombi WL7），对结晶紫具有较高的脱色能力，结晶紫含量为20 mg/L时，最高脱色率可达88.9%。结论：在结晶紫废水的处理领域WL7具有潜在的应用前景。

关键词：结晶紫；脱色；分离；16S rDNA序列

中图分类号 X703 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）02-0028-04

Abstract：Objective：To isolate and identify crystal violet decoloring bacteria.Method：Cultural，morphological，physiological and biochemical and 16S rDNA sequence characteristics were applied to confirm the classification of isolation strains.Preliminary study on different inoculation size，culture temperature，initial pH and culture time of strain WL7 on crystal violet decolorization performance were performed.Result：A bacterial strain WL7 capable of decolorizing triphenylmethane dyes crystal violet was isolated from the collected water samples.WL7 was identified as Arthrobacter rhombi.WL7 have high decolorization ability on crystal violet of 20 mg/L，the highest decolorization rate is 88.9%.Conclusion：WL7 has potential application prospect in the treatment of crystal violet wastewater.

Key words：Crystal violet；Decolorization；Isolation；16S rDNA sequence

结晶紫是一类难以降解且对许多生物都具有致癌、致畸性的三苯甲烷类染料[1-2]，廣泛应用于油墨、纸张、印染、制革和纺织等行业[3]，产生了大量高色度的染料废水，引起严重的水体和土壤污染[4]。目前水体中染料去除的主要方法有物理脱色法、化学脱色法[5，6]和生物脱色法[7-11]。物理和化学法见效快，成本高，易引起二次污染，其使用一直受到制约[12]。生物脱色法被视为一种环境友好型的方法[12-13]，主要包括吸附和降解脱色2种类型[10]，具有成本低、效率高等特点，越来越受到科研人员的青睐。理化方法处理三苯甲烷染料废水效果不理想，高浓度的三苯甲烷染料也抵抗微生物的矿化，因此寻找高效的三苯甲烷染料脱色菌已成为研究焦点，并对脱色方式及机理进行了大量研究[14-17]。本文以结晶紫为目标染料，分离并鉴定了一株结晶紫脱色菌WL7，并对其脱色机理和脱色性能进行了初步研究，旨在为三苯甲烷类染料染料的生物脱色方法及其在生产实际中的潜在应用提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂 样品采集自南阳市卧龙区某印染厂废水池上层水样。结晶购于紫天津市科密欧化学试剂开发中心；蛋白胨和牛肉膏购于北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂购于美国Sanland公司；无水乙醇（分析纯）购于莱阳市双双化工有限公司。

1.2 仪器及设备 精密电子天平（JJ300型，常熟双杰仪器厂）；恒温培养箱（GHP-9160型，上海一恒科技公司）；Nikon E-600微分干涉显微镜；离心机（DSX-280B型，上海申安医疗器械厂）；恒温振荡器（THZ-928型，上海跃进医疗器械厂）；高压灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；超净工作台（SW-CJ-1F型，苏州净化设备有限公司）；紫外及可见分光光度计（Evolution 600 BB型，英国热电公司）。

1.3 方法

1.3.1 培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基，其具体配方及配制方法见参考文献[18]，其中固体培养基琼脂含量为1.5%，富集和筛选培养基中结晶紫浓度均为20mg/L。

1.3.2 菌株富集和筛选 将从印染厂采集的染料废水取5mL接种于45mL富集培养液中在35℃、150r条件下进行培养，定期观察，取5mL脱色的富集培养物继续接种到45mL富集培养液中同条件下继续培养至脱色，挑取脱色液划线到含结晶紫的固体培养基上，于恒温箱内35℃培养至菌落产生，挑选菌落周围出现显著脱色区的菌落继续划线纯化获取单菌落，并对其进行单染色，用Nikon E-600微分干涉显微镜进行镜检。

1.3.3 分离菌株的鉴定 参照《常见细菌系统鉴定手册》的操作方法，对分离菌株的培养、形态及生理生化特征进行检测[19]；16S rDNA序列测定的测定委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行。将获得的16S rDNA序列在GenBank中进行同源性比较，选取同源性较高的16S rDNA序列，采用软件Clustalw2.0.10进行多序列匹配排列后MEGA6.05软件邻接法构建系统发育树。

1.3.4 分离菌株脱色性能的研究 菌株WL7接种于含50mL牛肉高蛋白胨液体培养基的250mL的三角瓶中，于35℃，150r培养24h制备种子液。以5%的接种量、转速150r、35℃、初始pH7和培养时间24h为基础条件，分别研究菌株WL7在不同接种量、培养温度、初始pH和培养时间对结晶紫的脱色效率，设置3个平行，定时取样，测吸光值。

1.3.5 脱色率检测 取培养液以8000r离心5min，在结晶紫最大吸收波长589nm处测量上清液的吸光值，以不接菌染料溶液为对照，结果取3个平行平均值计算脱色率[20]。以脱色率来表示菌株WL7对结晶紫的脱色能力：

脱色率（%）=（A0-At）/A0×100

式中：A0表示不接菌溶液的吸光值，At表示接菌t时间时溶液的吸光值。

2 结果与分析

2.1 染料脱色菌的分离 对采集的染料废水进行富集培养，选择脱色程度大及脱色时间短的培养物继续进行富集培养，脱色培养物划线含结晶紫的牛肉膏蛋白胨平板35℃培养，24h时选择周围形成明显的脱色圈的菌落继续划线分离纯化，获得一株染料脱色菌WL7。在牛肉膏蛋白胨平板上WL7菌落圆形隆起，呈乳白色，不透明，边缘整齐，菌体呈杆状，两端钝圆，无芽胞。

2.2 菌株WL7的生理生化特征 菌株WL7的生理生化特征见表1。从表1可以看出，菌株WL7接触酶阳性，氧化酶阴性，氧化葡萄糖不产酸不产气；硝酸盐还原、V.P.试验、甲基红试验、吲哚试验及硫化氢试验均为阴性。可以利用果糖、蔗糖、阿拉伯糖等多数碳源，不能利用棉籽糖和山梨醇。参照《常见细菌系统鉴定手册》，菌株WL7的生理生化特征与节杆菌属细菌高度相似[19]。

2.3 菌株WL7的分子鉴定 菌株WL7的16S rDNA的测序结果为1410个核甘酸，行BLAST比对，选取同源性较高的12株菌的16S rDNA序列匹配排列后构建系统进化树（图1），从图1可以看出，菌株WL7与节杆菌属的多株细菌同源性较高，与节杆菌（Arthrobacter rhombi）处于同一分支，因此结合生理生化特征初步把菌株WL7鉴定为一株节杆菌（Arthrobacter rhombi WL7）。株WL7与节杆菌属的多株细菌同源性较高，与节杆菌（Arthrobacter rhombi）处于同一分支，因此结合生理生化特征初步把菌株WL7鉴定为一株节杆菌（Arthrobacter rhombi WL7）。

2.4 菌株WL7的脱色性能

2.4.1 培养时间对脱色效果的影响 培养时间对脱色效果的影响见图2。由图2可知，接种量为5%，培养条件为35℃、150r、初始pH7时，24h的脱色率为81.3%；36h的脱色率即可达到85.6%，其后脱色率缓慢增加，72h的脱色率即可达到88.9%。培养至24h期间脱色率呈指数增长，其后脱色率相对稳定，无显著的提高，因此下述实验均考察24h的脱色率来比较菌株WL7的脱色性能。

2.4.2 接种量对降解效果的影响 从图3可以看出，培养24h接种量对脱色效果影响较大，接种量也大，培养时间内的脱色率越高。当接种量为1%～5%时，脱色率升高较快，当接种量高于7%后，脱色率均在87.3%以上，接种量对脱色率的影响趋于变小。接种量与脱色率呈正相关表明在培养24h内，接种量越大，菌体生长越迅速，延滞期越短，脱色效果越明显。

2.4.3 温度对降解效果的影响 考察了15～50℃范围内温度对脱色效率的影响，从图4可以看出，温度对脱色率的影响较大。温度为30℃时，24h的脱色率最高，可达到84.5%。15～30℃范围内，脱色率逐步提高，30～40℃范围内，脱色率逐步降低，45℃和50℃脱色率急剧降低，这可能是由于高温过高对菌株WL7生长有抑制作用，导致生物量过，也可能温度过高影响降解结晶紫的酶的活性，因而影响脱色效果。温度为20℃时，24h的脱色率仍可达到70%以上，表明菌株WL7对自然水体中结晶紫的去除有较大的潜在应用前景。

2.4.4 初始pH對脱色效果的影响 初始pH对脱色效果的影响如图5。由图5可知，初始pH对脱色效果影响也较大。初始pH为5和9时脱色率相对较低，pH为5时，脱色率脱色率仅为63.2%，初始pH在中性范围附近，24h的脱色率相对较高，pH为7时，脱色率脱色率达到最高，为81.7%。

3 讨论

从采集水样中分离得到一株三苯甲烷类染料结晶紫降解菌WL7，初步鉴定为一株节杆菌（Arthrobacter rhombi）。在不同接种量、培养温度、初始pH和培养时间下菌株WL7对结晶紫表现不同的脱色性能。菌株WL7在较高的温度和初始pH范围均有显著的脱色作用，当结结晶紫含量为20mg/L时，最高脱色率可达88.9%，因此在结晶紫工业废水的处理过程中具有潜在的应用前景，菌株WL7的脱色机理及脱色最佳工艺参数尚需进一步研究。

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（责编：张宏民）