芩补牙周缓释凝胶的制备及药剂学研究

刘 瑾, 仇冬冬, 孙俊毅,3,杨冬梅,裴丹丹,4,苟建重,李 昂

(1.西安交通大学口腔医院 陕西省颅颌面精准医学研究重点实验室,陕西 西安 710004; 2.西安交通大学口腔医院 牙周科,陕西 西安 710004;3.西安交通大学口腔医院 特诊特需科,陕西 西安 710004; 4.西安交通大学口腔医院 修复科,陕西 西安 710004)

药物应用是牙周炎治疗不可或缺的辅助手段,其中，中药治疗可避免西药长期使用造成的口腔菌群失调和细菌耐药性,同时具备效果稳定、副作用小、多靶点治疗等优点,成为现代中医药研究的热点之一[1-3]。研究表明,黄芩、骨碎补等中药煎煮剂可明显改善牙周炎症状下的菌群失调,促进牙周组织新附着形成[4]。黄芩、骨碎补的有效成分与其他中药配伍用药可明显降低牙周炎大鼠龈沟液、唾液及血液中PGE2和CRP水平，促进局部牙槽骨再生[5-8]。本课题组在前期研究中也发现，联合应用骨碎补中的活性成分柚皮苷与黄芩中的活性成分黄芩素，可明显增强人牙周膜细胞 (human periodontal ligament cells, hPDLCs) 的增殖、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性并促进矿化[9]。

局部缓释制剂作为牙周局部药物治疗的重要方式,是指将药物置于牙周袋内缓慢释放以减少给药次数，提供比较平稳的药物浓度制剂。在目前常用的几种牙周缓释剂型中,原位凝胶制剂因具有使用方便、患者感觉舒适、药物活性稳定、流动性好等特点，较为广泛地应用于临床[10-13]。

因此, 本研究通过检测不同中药配比下hPDLCs产生ALP的含量,获得黄芩提取物与骨碎补提取物最佳配伍质量比;进一步制备芩补中药缓释凝胶,并通过对形态学、pH值、流变学、稳定性、回收率及药物体外释放率等指标的考察,筛选药物最佳缓释浓度,为进一步考察芩补中药缓释凝胶用于实验性牙周炎模型体内治疗的药效学奠定实验基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

倒置相差显微镜(Nikon,日本);TL-40B低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);78HW-1恒温磁力搅拌器(杭州仪表电机厂);AA-250电子分析天平(Denver,美国);LC-2010高效液相色谱仪(日本岛津);SB5200DTD型超声震荡仪(宁波新芝生物科技股份有限公司);KDC-16H高速离心机(科大创新股份有限公司);酸度计PHS-3C(雷磁,上海)。

1.2 试药

骨碎补提取物(四川中药研究所,活性成分柚皮苷含量30.71%);黄芩提取物(陕西飞达生物有限公司,活性成分黄芩素含量80%);DMEM/F12(Dulbecco eagle′s minimum essential medium,DMEM);I型胶原酶、L-抗坏血酸-2-磷酸盐(Sigma公司,美国); 胎牛血清 (fetal bovine serum,FBS,Gibco公司,美国); 胰蛋白酶(1∶10)(Hyclone公司,美国); L-谷氨酰胺(华美生物工程公司); Antibiotic-Antimycotic (Atlanta Biologicals公司,美国);SABC 免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、角蛋白单克隆抗体、波形蛋白单克隆抗体(博士德,武汉); 羟乙基纤维素(hydroxyethyl cellulose,HEC,天津爱勒易医药材料有限公司);聚丙烯酸树脂(Eudragit RS PO,罗姆公司);甘油(国药集团化学试剂有限公司);三乙酸甘油酯(glycerol triacetate,GTA,北京精求化工有限责任公司)。

2 方法

2.1 黄芩、骨碎补提取物溶液配制

分别称取黄芩提取物、骨碎补提取物1 mg,用DMSO溶解成母液,过滤备用。用含10%FBS的DMEM细胞培养基配制成终浓度为黄芩提取物(以黄芩素为浓度监测指标)100、10、1.0、0.l、0.01 mg·L-1的溶液;骨碎补提取物(以柚皮苷为浓度监测指标)10、1.0、0.l mg·L-1的溶液,过滤除菌备用。

DMEM 培养基的配比:在超净台中,于成品DMEM培养基中加入10%的FBS,1%三抗,1% L-谷氨酰胺,1%Vitamin C,混匀,封口膜封口,4℃保存。

2.2 hPDLCs培养及鉴定[14]

在患者及家属知情同意下, 选取 12～29 岁患者的健康正畸牙或阻生牙, 所选牙齿均无龋坏、 根尖周炎及牙周炎, 术前根尖片显示所拔除牙齿根尖无明显骨质吸收、 牙周膜清晰完整。 采用酶消化结合组织块法进行hPDLCs原代培养: 拔牙后立即放入无菌含双抗的PBS液中， 转移至超净工作台后反复冲洗牙冠及牙根表面, 用无菌刀片刮除根中1/3牙周膜组织并剪碎, 11 200 r·min-1离心5 min, 移至小培养皿, 加入3 mg·mL-1Ⅰ型胶原酶1 mL,恒温消化30 min。加入DMEM,1 000 r·min-1离心3 min,弃上清,加入含体积分数为20%FBS、三抗的DMEM培养基5 mL,吹打混匀移入培养瓶中培养, 3～4 d 换液去除未贴壁组织, 倒置相差显微镜下观察细胞形态。 待细胞长满瓶底约80%, 即可进行传代培养。 将第3代hPDLCs制备成细胞爬片,HE 染色和sABC免疫组化染色后在光镜下观察细胞形态,进行细胞鉴定。

2.3 ALP法检测黄芩、 骨碎补提取物复方对hPDLCs成骨的影响

单味药物实验分组

1) 黄芩提取物组:黄芩素(100、10、1.0、0.l、0.01 mg·L-1)；

2) 骨碎补提取物组:柚皮苷(10、1、0.1 mg·L-1)。

复方药物实验分组

1) 1.0 mg·L-1黄芩提取物+骨碎补提取物(10、1、0.1 mg·L-1)；

2) 0.1 mg·L-1黄芩提取物+骨碎补提取物(10、1、0.1 mg·L-1)；

3) 0.01 mg·L-1黄芩提取物+骨碎补提取物(10、1、0.1 mg·L-1)。

取第 4 代 hPDLCs, 消化后调整细胞浓度至1×105mL-1,按照每孔200 μL 细胞悬液接种于96 孔板,标准环境下孵育24 h。按照上述分组外加1个阴性对照组,每组4个复孔,实验组每孔加药物培养液200 μL,对照组为 DMEM 液(含10%FBS)。作用5 d 后, 收集细胞培养上清液。 按照ALP试剂盒使用说明,在测定管、标准管、空白管中加入显色剂1.5 mL混匀后,空白管调零,在波长520 nm下,用紫外分光光度仪测定各管吸光度(A520)值,再换算出各个样本 ALP 的活性,并采用SPSS18.0统计软件做独立样本单因子变异数分析。

2.4 芩补中药缓释凝胶的制备

以羟乙基纤维素、甘油、聚丙烯酸树脂、三乙酸甘油酯为主要辅料，分别制备了浓度为2%、4%、6%的芩补中药缓释凝胶(即黄芩、骨碎补提取物复方占总凝胶成分的质量分数为2%、4%、6%)。制备过程如下:

1) 取处方量的甘油保持90℃～100℃恒温,加入处方量羟乙基纤维素,高速搅拌至完全溶解后降温至45℃～50℃,按质量比1∶1的比例加入处方量黄芩、骨碎补提取物,低速搅拌至溶解;

2) 另取处方量的三乙酸甘油酯保持45℃～50℃恒温,搅拌下加入处方量聚丙烯酸树脂,至完全溶解后,低速搅拌加入到步骤1)中,45℃～50℃保温条件下搅拌至均质即得芩补中药缓释凝胶。

2.5 芩补中药缓释凝胶制剂学考察

2.5.1 形态学考察 按2.4方法制备芩补中药缓释凝胶,观察其物理性状。

2.5.2 pH值考察 取缓释凝胶0.5 g,置于50 mL纯化水中,静置1～7 d,使用酸度计每日检测pH值。

2.5.3 稳定性考察

1) 冷冻试验:将复方中药缓释凝胶置于-20℃冰箱,24 h后复融,观察凝胶有无分层及颜色改变。

2) 加热试验:将复方中药缓释凝胶置于50℃恒温培养箱内3个月,观察凝胶有无分层及颜色改变。

3) 离心试验:将复方中药缓释凝胶置于离心管中,3 500 r·min-1离心30 min,观察凝胶是否分层。

4) 流动性试验:采用目测方法,观察不同浓度复方中药缓释凝胶的流动性。

2.5.4 体外释放率的测定 色谱条件:色谱柱(shimadzu VP-ODS 柱),流动相：甲醇∶水(体积分数0.4%冰醋酸,体积分数0.2%三乙胺)=40∶60,流速0.8 mL·min-1,柱温37℃,检测波长280 nm，进样量10 μL。

对照品配置:分别精密称取柚皮苷、黄芩素标准品10 mg置10 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容,摇匀作为对照品贮备液。

1) 系统适应性考察:精密吸取对照品溶液、药物缓释液、空白凝胶缓释液各10 μL,在上述色谱条件下检测。

2) 线性试验:分别吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的对照品贮备液于10 mL容量瓶中,用甲醇将其稀释成10、20、30、40、50 μg·mL-1的系列浓度标准溶液,分别进样测定,记录色谱图,进行线性分析。以峰面积A为横坐标,浓度C为纵坐标,进行线性回归。

3) 精密度试验:精密吸取同一对照品溶液,在280 nm处连续测5次。记录峰面积,并计算峰面积相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)值。

4) 回收率试验:取黄芩、骨碎补提取物适量,精密称定,用甲醇溶解定容至刻度,分别制成含黄芩素、柚皮苷浓度为30、40、50 μg·mL-1的样品溶液。在280 nm条件下检测并按照线性回归方程计算浓度。

5) 体外缓释试验:取约0.5 g制备好的芩补中药缓释凝胶注入自制的扩散池中均匀铺开,将其加入含50 mL去离子水的烧杯中,加盖密封,放入恒温空气浴摇床(37℃,转速40 r·min-1)中,分别于1～7 d后将容量瓶中溶液全部取出,再补加相同温度的释放介质50 mL,放回。取释放介质液20 μL,40 μmm滤膜过滤,用HPLC法检测释放液中药物的含量,计算出一定时间点黄芩素、柚皮苷的释放率和累积释放率。

3 结果

3.1 hPDLCs培养及鉴定

采用酶消化结合组织块法,1周即可看到hPDLSs从组织块周围爬出并贴壁生长;4周后细胞生长速度加快并呈一定方向排列(见图1A，B); HE染色后,光镜下观察到细胞呈长梭形或多角形,有数个长短不一的突起,胞体丰满,胞浆着红色，胞核着蓝紫色(见图1C);免疫组化染色后,可见抗波形蛋白染色阳性胞浆呈棕黄色(见图1D),角形蛋白染色阴性(见图1E)，说明所培养的细胞来源于外胚层间充质,而非上皮组织。结合取材部位及细胞形态学观察可以确定是 hPDLCs。

A 原代培养1周：组织块周围长出的hPDLCs(200×)；B 原代培养4周：待传代的hPDLCs呈放射状及漩涡状(200×)；C HE染色：细胞呈长梭形或多角形，有数个长短不一的突起(1 000×)；D 波形蛋白染色阳性(1 000×)；E角形蛋白染色阴性(1 000×)图1 hPDLCs的培养及鉴定 Fig.1 Culture and identification of hPDLCs

3.2 ALP法检测黄芩、骨碎补提取物复方对hPDLCs成骨的影响

不同配比的黄芩和骨碎补提取物复方对细胞ALP活性的影响不同,但普遍高于单味药物对细胞ALP活性的促进作用。其中，ALP活性值最高的组方为1 mg·L-1黄芩提取物与1 mg·L-1骨碎补提取物(质量比1∶1),其明显高于对照组及单味药组的促进作用,且有显著性差异(*p<0.05;**p<0.01)(见表1)。

表1 不同浓度和配比的黄芩提取物和骨碎补提取物对hPDLCs碱性磷酸酶活性的影响Tab.1 Effect of naringin and baicalin combination on ALP activity of

续表1

3.3 芩补中药缓释凝胶制剂学考察

3.3.1 形态学考察 黄芩、骨碎补提取物按黄芩素与柚皮苷质量比1∶1制备2%、4%、6%不同浓度的缓释凝胶,外观为黄褐色乳膏状,具有一定的稠度,呈非自由流动的流体状态(见图2)。

图2 4%浓度的芩补缓释凝胶Fig.2 4% concentration of qinbu sustained-release gel

3.3.2 pH值考察 制备的2%、4%、6%凝胶pH值为7.2～7.4(见表2),符合《中国药典》2020版规定的凝胶制剂pH值不超过8.0的要求。

表2 不同浓度的芩补缓释凝胶pH值Tab.2 pH values of qinbu sustained-release gel at different concentrations

3.3.3 稳定性考察 由表3可知,2%、4%、6%三种浓度的凝胶离心、冷冻、加热后均不分层、不变色,其中2%、4%的凝胶流动性较好,但6%芩补中药缓释凝胶流动性及通针性差,故选择2%、4%浓度的芩补中药缓释凝胶用于下一步实验。

表3 2%、4%、6%浓度的芩补中药缓释凝胶稳定性考察Tab.3 Stability of qinbu sustained-release gel with different concentrations of 2%, 4%，6%

3.3.4 体外释放率的测定

1) 系统适应性考察:药物缓释液和对照品液在相应的位置上均出现色谱峰,且药物缓释液色谱峰中基线稳定,分离度良好。空白凝胶液在该位置没有峰出现,说明基质液对药物检测无干扰(见图3～6)。

图3 柚皮苷对照品色谱图Fig.3 Chromatogram of naringin reference substance

图4 黄芩素对照品色谱图Fig.4 Chromatogram of baicalein reference substance

图5 芩补凝胶色谱图Fig.5 Chromatogram of qinbu gel

图6 空白凝胶色谱图Fig.6 Chromatogram of blank gel

2) 线性试验: 经计算得柚皮苷在0.1～20 μg·mL-1的范围内线性关系良好，回归方程为A=2.4E-5C+0.094 4R2=0.999 6;黄芩素在1～50 μg·mL-1的范围内线性关系良好,回归方程为A=1.6E-5C+2.618 6R2=0.993 1。

3) 精密度试验：测得黄芩提取物峰面积RSD为0.15%,柚皮苷峰面积RSD为0.29%,表明仪器性能稳定。

4) 回收率试验:黄芩素、柚皮苷精密度分别为RSD 0.15% (n=5)、0.29%(n=5)，分别测量黄芩素、柚皮苷低、中、高(30、40、50 μg·mL-1)3个质量浓度的平均回收率为黄芩素99.62%,RSD 0.288%(n=9);柚皮苷99.02%,RSD 0.417%(n=9)。

5) 体外缓释试验:由图7可知,质量分数2%、4%的芩补中药缓释凝胶中药物释放均可分为2个阶段:第一阶段，是将凝胶注入到去离子水中至凝胶凝结后,在该阶段存在“突释”现象,即2%、4%浓度的芩补缓释凝胶中柚皮苷在第2天的释放率相较于第1天分别增长了12%和22%,黄芩素则分别增长了20%和19%;第二阶段，是凝胶凝结后稳定释药阶段,释放率基本稳定。存在“突释”现象的原因，是由于凝胶中的聚丙烯酸树脂具有网络结构和亲水基团,吸水膨胀倍数较高,其凝胶结构水通道空腔尺寸大导致药物沿孔道迅速释放，产生了“突释”现象。此外,2%、4%浓度的芩补缓释凝胶中黄芩素的“突释”现象也可能与黄芩素易于降解有关。4%浓度的芩补中药缓释凝胶中黄芩素和柚皮苷的释放曲线良好，且7天累积释放率达80%以上。因此，4%浓度为芩补中药缓释凝胶的最优处方。

图7 芩补中药缓释凝胶中黄芩素、柚皮苷7d累积释放情况Fig.7 7 days cumulative release of naringin and baicalin in qinbu sustained-release gel

4 讨论

牙周局部用药的方式包括:含漱、局部冲洗、涂布，以及牙周袋内应用缓释和控释药物等。前三者作用时间短,对牙周袋内的菌群无显著影响。缓释和控释药物则能直接靶向作用于牙周袋内的病变组织，使病变局部较长时间维持有效药物浓度，达到抑菌、杀菌等目的。目前，常用的几种缓释剂型包括纤维条、膜剂、微球、棒剂、原位凝胶等,各具优缺点。纤维条使用方便、用药量少,但因其不可吸收,影响创口愈合;膜剂可吸收,但可变性差,易脱膜,易造成患者不适;微球可降解,但因其突释效应导致规模化生产困难;棒剂起效快,用药量少,但药物释放率低,患者体验感差;原位凝胶(如派丽奥)因其具有流动性好、与牙周袋形状贴合等优势近年来备受临床医生青睐[15-16]。因此，本研究采取原位凝胶缓释剂型。

本课题组前期研究发现，黄芩素、骨碎补柚皮苷均可促进hPDLCs增殖,骨碎补柚皮苷对hPDLCs成骨还有促进作用。前期制备的黄芩提取物缓释凝胶对小型猪牙周炎具有明显的消炎作用,但无明显成骨作用。因此，本研究根据中医配伍理论,将黄芩提取物与骨碎补提取物按一定比例混合,采用ALP法测定单味及中药复方对人牙周膜细胞成骨的影响,证实复方中药的成骨作用优于单味中药,得到黄芩提取物与骨碎补提取物最佳质量比为1∶1,进一步制备芩补缓释凝胶,利用高效液相色谱法(HPLC)[17-19]等对其进行了形态学及稳定性分析,结果符合凝胶制剂的质量标准[20]。最终确定4% 的芩补缓释凝胶释放效果最优,7 d累计释放率均可达 80%以上。后续还将对该芩补缓释凝胶的毒理作用进行深入研究,为临床牙周炎药物应用奠定基础。