树莓中鞣花酸的提取及生物活性研究进展

张鑫宇，王亚菲，应 茵，王雪山

（枣庄学院食品科学与制药工程学院，山东枣庄 277160）

树莓是蔷薇科悬钩子属的落叶小灌木，传统中药名为“覆盆子”，又名“山莓”“托盘”等，果实营养丰富，可入药，是一种药食同源植物。据记载，树莓是最先被证明含有鞣花酸的植物之一，并且是抗癌物质鞣花酸的最佳来源之一[1]。研究表明，鞣花酸具有良好的抗氧化、抗癌和抑菌消炎等生物活性，还有镇静、降压等作用，具有很高的利用价值[2]。近年来，树莓鞣花酸的提取及分离纯化工艺发展迅速，已成为国内外的研究热点。

我国野生树莓资源丰富，适合树莓生长的地区广泛，从树莓中提取鞣花酸，并深入研究其生物活性具有重要的意义。本文对树莓鞣花酸的提取、分离和纯化方法进行了总结，同时介绍了鞣花酸的生物活性，以期为树莓鞣花酸的进一步开发应用提供思路。

1 树莓鞣花酸的结构及提取纯化方法

1.1 鞣花酸结构及理化性质

鞣花酸是一种天然存在的酚类内酯化合物，其分子式为C14H6O8，分子结构如图1 所示，含有四个酚羟基、两个内酯基团[3]，显弱酸性，大部分以缩合形式（包括鞣花苷、鞣花单宁等）存在[4-5]。

图1 鞣花酸的化学结构式Fig.1 Chemical structural formula of ellagic acid

纯净的鞣花酸呈现黄色结晶粉末的形态，溶解度随pH 的增加而增加，可溶于碱性水溶液和醇[6]。鞣花酸与不同化合物反应会呈现不同颜色，如与硫酸反应呈黄色，遇三氯化铁显现蓝色等[7-8]。

1.2 鞣花酸的提取方法

在目前的研究中，鞣花酸提取方式主要有溶剂浸提法、超声波辅助提取法和微波辅助提取法等。

1.2.1 溶剂浸提法

溶剂浸提法是使用广泛，也是较早应用于鞣花酸提取的一种方法。将原料破碎后，加入有机溶剂，在一定温度下，提取一定时间后进行过滤和浓缩，可以得到鞣花酸粗提物[9]。刘卉等[10]以树莓叶为原材料，考察了影响鞣花酸提取率的关键因素，发现提取剂浓度的影响最为显著，然后依次是提取温度、提取时间和固液比，最终得出乙醇浓度80%、提取温度95 ℃、提取时间60 min、固液比3∶140（g/mL）的组合最为合适，在此条件下鞣花酸的提取量最大，达到0.432 8 mg/g，这与吴士龙等[11]的研究结果相似。在常用的四种溶剂（甲醇、乙醇、丙酮、盐酸）中，李小萍[12]以红树莓为原材料，通过对比分析以挑选出最佳提取溶剂，发现丙酮提取得率最高，经过优选工艺条件，确定选用80%的丙酮进行萃取，在80℃下萃取90 min，最终可得到含量为322 μg/g 的鞣花酸提取物。

1.2.2 微波辅助提取法

微波辅助提取法（MAE）是利用微波破坏细胞壁加快释放可提取化合物的一种方法[13]。Theocharis 等[14]研究表明，MAE 的最佳条件取决于待测物质的类型及其对微波的吸收程度。Sun 等[15]通过扫描电镜发现，乙醇产量高、毒性低，是微波辅助提取的最佳培养基。崔珊珊等[16]以乙醇为提取剂，考察各影响因素后发现，微波功率的影响最为显著，并得出最优条件为采用50%乙醇在60 ℃下提取1.8 min，固液比1∶19（g/mL），微波功率411 W，测得提取量为827.5 μg/g。

1.2.3 超声波辅助提取法

超声波辅助提取法主要是通过超声波的机械振动以及空化作用对鞣花酸进行提取[17]。王佳慧等[18]研究表明，利用超声波提取19.72 min，在提取温度80.02 ℃、固液比1∶14.04（g/mL）的组合下，树莓鞣花酸的提取量最大，为670.28 μg/g，并且通过分析各因素对鞣花酸提取率的影响，发现料液比、提取时间对其影响较为明显，这与赵慧芳等[19]的发现相似。此外，Sebojka 等[20]在树莓鞣花酸的提取实验中也利用了超声波来辅助提取，提取量达到了40.06 mg/100 g。

1.2.4 鞣花酸提取方法的比较

表1（见上页）分析了上述几种提取方法，并对它们的优缺点进行了总结。由表可知，与传统溶剂提取法相比，借助超声波和微波进行辅助提取能极大地提高提取效率。

表1 鞣花酸提取方法的比较Table 1 Comparison of extraction methods of ellagic acid

1.3 树莓鞣花酸的分离纯化

鞣花酸粗提物中含有大量的杂质，对粗提物进一步分离纯化才能达到更高的纯度。树莓鞣花酸纯化的方法主要有以下几种。

1.3.1 高速逆流色谱法

高速逆流色谱法（HSCCC）早在20 世纪70 年代由Ito 博士研发出来，是一种高效、新型的色谱分离方法，因组分在固定相与流动相（两相都是液体）中分配系数不同而实现分离[23]。

溶剂体系的选择是HSCCC 的关键环节，Ding 等[24]研究表明，若选用对鞣花酸溶解度较低的两相溶剂体系，不断增加样品量，鞣花酸纯度不会提高。辛秀兰等[25]在利用HSCCC 分离纯化树莓鞣花酸时，在体积比为丁醇∶异丙醇∶水=2∶1∶3 的条件下进行了两相溶剂体系的配制，设置流速为2 mL/min，机器转速为850 r/min，且选择了梯度洗脱方式来替换高速液相洗脱，可使鞣花酸纯度达到81.6%。另外，Jikai 等[26]发现，每隔2.5 h 注射鞣花酸粗品，可以加速分离而快速获得较高纯度的鞣花酸。

1.3.2 大孔树脂吸附法

大孔树脂吸附法是一种物理吸附方式，因其对不同组分的吸附及筛选力度不同，进而达到分离提纯[27]。李庆等[28]在试验中发现，用乙醇溶液洗脱时可以在低浓度下将鞣花酸洗脱出来，得到较高纯度的鞣花酸。王佳宁[29]也发现50%乙醇对鞣花酸具有较好的溶解性，而浓度过高或过低都会溶解出较多杂质，不利于鞣花酸的分离。崔珊珊[30]采用X-5 大孔树脂分离纯化红树莓中的鞣花酸，得出经吸附、水洗、50%乙醇溶液洗脱，回收率达到了83.56%，纯度达到了50.53%，且对比分析发现，纯化后鞣花酸的粒径显著减小，纯化后的粉体更加细腻、均匀。

1.3.3 分离纯化方法的比较

目前，关于树莓鞣花酸的分离纯化方法较少，且存在一些问题。表2 对上述几种方法进行了比较。

表2 分离纯化方法的比较Table 2 Comparison of separation and purification methods

2 树莓鞣花酸的生物活性

2.1 抗氧化及自由基清除作用

鞣花酸是一种天然的抗氧化剂[32]，起抗氧化作用的因素之一是它清除自由基的能力[33]。李小萍等[9]通过还原力测试、抗油脂氧化试验和自由基清除试验，证实了红树莓鞣花酸对·OH 与DPPH 自由基的清除作用非常显著，并且具有很强的抗油脂氧化能力。Beekwilder 等[34]研究发现，树莓鞣花酸清除·OH 和DPPH 自由基的效率分别达到74.8%和57.82%。此外，李俊[35]分离得到几种不同纯度的树莓鞣花酸提取物，对它们进行抗氧化能力的比较，发现其抗氧化能力与鞣花酸含量成正比。崔珊珊等[16]发现通过不同方法得到的鞣花酸提取物，它们的抗氧化能力存在一定的差异。

2.2 抗炎性及抑菌性

鞣花酸可以抑制溃疡，保护伤口避免细菌的感染，达到消炎的作用。NF-κB 是炎症的中心因子[36]，Rosillo 等[37]发现，鞣花酸能够抑制NF-κB 活化，抑制炎症中心因子的表达。Marin 等[38]研究表明，鞣花酸可以减弱小鼠结肠炎症状，且可以有效治疗溃疡性肠炎。Enrico 等[39]以树莓为原料，从中提取出鞣花酸，在TNF-α 和IL-1β 刺激的胃细胞系AGS 上检测其抗炎活性，结果表明，树莓鞣花酸提取物可以抑制NF-κB 核转位，并且能使大鼠溃疡指数降低75%，有效降低炎症反应。

鞣花酸对不同种类的细菌有不同程度的抑制作用。辛秀兰等[40]发现，鞣花酸能够显著降低大肠杆菌、枯草杆菌等细菌的活性，而对霉菌、黑曲霉以及酵母菌的抑制效果并不突出。闫莉等[41]通过实验发现，其抑菌作用机理可能与破坏细菌的细胞膜有关。Thiem 等[42]的研究也表明鞣花酸在人体内具有抗菌活性，并且直接服用鞣花酸对人体无危害。

2.3 抑制肿瘤及抗癌性

树莓鞣花酸在抑制肿瘤方面有良好的效果，且具有抗突变、抗癌变效应。杨洪亮等[43]对鞣花酸抗肿瘤机制进行了研究，提出了其作用机理可能与抑制DNA 合成、阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡有关。崔珊珊[30]通过建立红树莓鞣花酸体外抗氧化与肺癌细胞A549 增殖活性之间的相关性，发现二者呈显著的正相关关系，证实了红树莓鞣花酸对A549 的增殖具有明显的抑制作用。刘畅[44]研究发现，随着红树莓鞣花酸浓度的增加，肝癌细胞的存活率会越来越低。钟晨[45]证实鞣花酸对肝癌的抑制作用表现在它使HepG2 的细胞周期滞停在G0/G1 期，能进一步促进HepG2 细胞的凋亡。

2.4 其他生物活性

除上述几种生物活性外，树莓鞣花酸还有很多的生物活性，如Kang 等[46]发现，树莓籽粉中的鞣花酸对高糖高脂饮食导致的血脂异常有明显的改善作用，还可以通过减轻肝脏内质网应激与氧化应激反应，从而有效降低高糖高脂饮食引起的代谢并发症，达到预防肥胖的效果。也有研究表明，红树莓鞣花酸可以保护正常细胞免受某些食品添加剂或化学物质造成的致癌毒素的侵扰[47]。一定剂量的鞣花酸能够减弱顺铂抗癌药物通过不同机制引起的肾毒性[48]，还有助于减轻饮酒导致的肝毒性[49-50]。

3 结论及展望

目前树莓鞣花酸的提取工艺及分离纯化技术还存在一些不足，有些副产物对环境造成一定影响。随着仪器与科技的不断发展，未来会有更多高效且绿色安全的方法被研发出来。近年来发展了一些新型技术，如超声波-微波协同提取技术、膜分离技术等，但还未应用到树莓鞣花酸的提取及分离中。

鞣花酸具有良好的抗氧化、抗癌及抑菌等生物活性，且随着研究的深入，鞣花酸的药用价值和保健功效更多地被挖掘出来。近年来，国外鞣花酸功能性食品畅销，而我国鞣花酸相关产品还很少，具有广阔的发展前景。因此应不断优化树莓鞣花酸的提取工艺，在医药和保健品领域发挥其更大的价值，以期促进树莓产业长久发展。