单细胞转录组测序在家畜生产中的应用

夏银钊，何天乐，陈俊材，唐志如，杨震国 (1.西南大学 动物科学技术学院 生物饲料与分子营养实验室，重庆 400715)

近年来，转录组测序技术在家畜生产中广泛应用对于有效检测家畜转录组和深刻理解家畜转录水平的相关调控有重要意义[1]。常规的家畜转录组测序分析通常是将动物的整个器官或组织均质化，得到的测序结果是所有细胞的平均值，忽略了单个细胞间基因表达的异质性，这对于理解数量少的细胞和单个细胞的转录过程十分局限[2-3]。而单细胞转录组测序(single cell RNA-seq，scRNA-seq)技术可将从动物组织分离出的单个细胞的微量全转录组RNA扩增后进行高通量测序，进而在单细胞水平上获得全转录组的表达谱[4]，应用scRNA-seq研究家畜配子发生、早期胚胎发育、肌肉发育和营养代谢调控等方面问题，可以精准地得到每个细胞的表达谱来检测细胞组分的变化[5-6]，从而使人们更好地理解家畜相关生理活动在转录水平上的调控机制。现就scRNA-seq的技术要点以及其在动物研究中应用的适用性展开系统讨论，以期为家畜相关研究提供方法指导和理论依据。

1 scRNA-seq技术要点

1.1 单细胞分离技术进行scRNA-seq需要将细胞从组织中分离出来，获得大量的细胞用于后续的高通量测序。现阶段较成熟的单细胞分离技术方法有：显微操作技术(micromanipulation technique，MT)、口吸移液法(mouth pipette method，MP)、极限稀释法(limiting dilution technique，LD)和激光捕获显微切割(laser capture microcutting，LCM)[7-8]。同时，根据微流体和液滴拓展而来的微流控(microfluidics)、MagSweeperTM[8]、DEP-ArrayTM[9]、CellCelectorTM[10]、 Nanofilters[11]、Cell-SearchTM[12]和荧光激活流式细胞分选(fluorescence-actived cell sorting，FACS)技术具有更高的精确度和特异性。

1.2 cDNA文库构建动物单个细胞中RNA含量较少，仅10～20 pg[13]，因此，进行单细胞测序时需要对单个细胞中的超微量核酸进行扩增，增加核酸总量至纳克水平用于后续分析。根据第2链cDNA合成时使用的酶不同，扩增方法主要有PCR扩增、IVT扩增和Phi29聚合酶法[14]。随后，采用高通量测序技术对扩增后得到的转录组进行测序，得到大量的原始读长(reads)，初步得到单细胞转录组数据[15]。

1.3 数据处理与分析初始得到的单细胞转录组数据有上百万个reads甚至更多，需经过计算机分析处理系统处理后才能获得有用信息。数据处理与分析步骤如图1所示。

图1 数据处理与分析步骤[16-21]

2 scRNA-seq在家畜研究中应用的适用性

单细胞转录组测序技术具有精准性和特异性的特点，可在单细胞水平上对动物基因表达模式进行分析。根据scRNA-seq本身所具有的技术优势分析单细胞转录组测序技术在家畜研究中应用的适用性有利于畜牧业的发展。

2.1 单细胞多组学研究近年来，常规多组学关联分析开始应用于畜禽表观遗传和肉质性状研究[22]。YANG等[23]通过对瘦肉型猪、脂肪型猪的甲基化组、miRNAs、mRNA和lncRNA转录组进行关联分析，鉴定了大量与肌肉发育相关的调控通路。JIN等[24]通过比较保育期和育成期猪背最长肌的甲基化组和mRNA转录组的图谱差异，鉴定了大量肌肉中甲基化水平与表达随年龄变化的基因。然而，常规的多组学关联分析对于细胞数目较少的样品难以开展后续研究[2-3]。单细胞多组学技术可在同一细胞中捕获分析2种以上的组学信息[25-26]，能充分体现细胞间的本质差异，更好地反映基因变化与表型变化之间的关联性并同时解决普通组学分析存在的平均化效应问题。此外，应用scRNA-seq于哺乳动物早期胚胎同时进行多组学分析，可以克服哺乳动物早期胚胎细胞数量少的限制，这对于探究遗传信息如何按照时间和空间顺序调控个体有重要意义[25]。

2.2 动物免疫学研究动物免疫细胞对抗原应答反应具有异质性，而scRNA-seq适于分析免疫细胞的异质性[27-30]。应用scRNA-seq于免疫系统研究可获取单细胞水平分析免疫细胞转录组的表达谱[27]，对于揭示免疫细胞异质性[28]、揭示免疫应答异质性[29]、揭示免疫耐受异质性[30]、发现新的细胞标志物[31]并鉴定免疫细胞亚群[32]和发现动物免疫细胞的潜在功能[33]有重要意义。此外，scRNA-seq技术对于研究家畜免疫系统、鉴定动物免疫细胞亚群、鉴定新的免疫细胞特异性基因以及揭示免疫系统进化具有针对性作用[34]。

2.3 发育生物学研究应用scRNA-seq研究组织器官发生是当下研究热点之一。YIN等[35]运用scRNA-seq解析了小鼠肢体发育过程中同时间点细胞的动态转录特征。CAO等[36-37]分析9.5～13.5 d的61个小鼠胚胎约200万个细胞的转录组，构建原肠胚的3个胚层发育成不同器官的小鼠胚胎细胞图谱，之后利用自主研发的单细胞测序技术Sci-RNA-seq3分析来自121个人类胎儿器官的约400万个单细胞的转录组，上述研究共同构建了细胞和基因从胚胎到胎儿发育的动态轨迹，为当前发育生物学研究开拓新视野。scRNA-seq技术的不断发展和应用还推动了生物机体发育的分子机制和细胞程序的研究，实现在单细胞水平上追踪生物发育[38]。发育生物学作为动物人工繁殖、遗传育种和动物胚胎工程等畜牧生产应用技术的理论基础，其中涉及的有关细胞分化机理、基因表达调控及功能研究，是解决动物细胞与组织培养和基因工程等实用技术的前提和基础。因此，scRNA-seq技术本身具有的鉴定细胞类型和识别标记基因的特点将有力推动动物发育生物学的研究，这对于完善与家畜有关的配子体外成熟、体外胚胎培养技术和实现家畜的品种改良与扩繁有重要意义。

3 scRNA-seq技术在家畜生产中的应用

3.1 配子发生精子发生期间，附睾中精子携带的非编码RNA片段被作为父本表观遗传信息来影响胚胎发育和后代表型，为研究来自于附睾上皮的相关tRNA片段(tsRNAs)对于胚胎发育的早期卵裂阶段的影响，CHEN等[39]对体外受精猪卵母细胞显微注射反义序列后对胚胎进行scRNA-seq检测，结果表明，参与猪植入前胚胎早期分裂的1个tsRNAs组即Gln-TTGs在成熟精子中存在并对着床前胚胎的早期分裂发挥着重要作用。精子发生需要生殖细胞与睾丸间质细胞、支持细胞和免疫细胞等体细胞共同作用完成，YANG等[40]对绵羊精子发生中生精细胞(早期初级精母细胞、晚期初级精母细胞、圆形精子细胞、细长精子细胞及精子)和睾丸体细胞进行scRNA-seq检测，并通过进一步研究鉴定了绵羊生殖细胞和相关体细胞的几个阶段特异性标记基因，如EZH2、SOX18、SCP2、PCNA和PRKCD，功能富集分析后发现间质细胞和支持细胞的标记基因主要富集在核糖体途径，各阶段生殖细胞的标记基因集中在细胞周期、蛋白质加工、mRNA转录监控和配子产生途径，在单细胞转录组水平上探明了绵羊精子发生过程中各种细胞类型特异性基因的表达变化，为进一步研究绵羊生精细胞发育和精子发生提供理论基础。

卵母细胞在减数分裂过程中发生的组蛋白修饰会作为内在因素影响卵母细胞的成熟，LIU等[41]通过scRNA-seq技术处理山羊生发泡期(GV)和中期(MⅡ)卵母细胞，鉴定出4 516个差异表达基因，其中有16个是参与组蛋白修饰的酶基因，通过体外细胞试验验证了其中的1个组蛋白修饰酶基因即组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶(LSD1)在卵母细胞体外受精时造成卵母细胞减数分裂进程停滞，测序结果呈现了卵母细胞成熟过程中基因的动态变化，并为进一步研究山羊卵母细胞减数分裂成熟提供理论基础和技术手段。在畜牧生产中，环境污染物可作为外在因素影响哺乳动物卵母细胞减数分裂并损害卵母细胞的质量[42]。7，12-二甲基苯并[a]蒽(DMBA)是一种普遍存在于烟雾中的有毒化学品，研究表明DMBA能够影响猪卵母细胞的减数分裂，其中包括DNA双链断裂、活性氧、线粒体膜电位、早期凋亡、组蛋白甲基化修饰和后续的发育能力[43]。然而，DMBA如何影响卵母细胞减数分裂和发育能力的分子机制还有待进一步研究。scRNA-seq作为一种研究少量分子材料的优势技术，还可以用来揭示化学物质诱导的卵母细胞转录组的变化。YANG等[44]通过scRNA-seq技术研究经DMBA处理后猪MⅡ卵母细胞中转录组的变化，鉴定了19个蛋白编码基因和156个新的lncRNA(long noncoding RNA，lncRNA)，这些差异表达基因集中在鞘磷脂生物合成、尼古丁成瘾、基础转录因子和核苷酸切除修复等信号通路中，为进一步研究这些差异表达基因在调节DMBA对生殖影响中的功能及作用提供依据。

3.2 早期胚胎发育动物生产中，通过卵母细胞体外成熟(invitromaturation，IVM)、体外受精(invitrofertilization，IVF)、体外胚胎生产(invitroproduction，IVP)和体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)等技术生产的牛和羊体外胚胎，可以有效缩短世代间隔，提高牛羊育种效率，对于后代遗传质量的把控以及相关发育疾病的研究有着重要意义。然而，由于人为难以复刻动物胚胎发育的母体环境，在应用这些体外胚胎生产技术时会出现胚胎发育率低、发育迟缓和囊胚率低的问题。借助scRNA-seq技术可以在单细胞水平上对早期植入前胚胎基因表达进行研究，分析胚胎发育中的相关基因功能，且可同时进行多组学分析其中的代谢途径和细胞通路，为进一步完善牛羊体外胚胎生产技术提供理论基础。李斐然[45]分别对体内正常发育胚胎、体细胞克隆胚胎和体外受精胚胎的蒙古绵羊早期胚胎的3个阶段(2，4，8-细胞)进行scRNA-seq检测，进而分析不同来源的早期胚胎的基因表达差异，GO分析后发现处于同一发育时期的3种胚胎的差异表达基因集中在代谢进程、发育进程、有机环状化合物进程和氮代谢等代谢路径中，KEGG富集分析表明3种来源胚胎的差异表达基因主要集中在ATP结合盒式蛋白、氧化磷酸化、cAMP通路、细胞黏附和错配修复等细胞通路上，最终在单细胞水平上阐明了绵羊体外受精胚胎和克隆胚胎发育潜能差的原因。王晶晶[46]采用scRNA-seq技术对牛体内正常形成囊胚、新鲜牛卵母细胞IVF胚胎和玻璃化冷冻牛卵母细胞IVF囊胚分别进行全转录组分析，然后对差异表达的mRNA、lncRNA和circRNAs进行GO注释和KEGG功能富集分析，结果表明，牛体内形成囊胚与玻璃化冷冻卵母细胞IVF囊胚在糖酵解通路上差异表达基因显著富集，牛体内形成胚胎与玻璃化冷冻卵母细胞IVF囊胚在氧化磷酸化通路上差异表达lncRNA显著富集，最终通过scRNA-seq技术筛选到相关显著上调的差异表达基因，从而在单细胞水平上揭示了转录组异常导致的体外生产胚胎和体内形成胚胎在卵裂率以及后续妊娠率和产犊率的差别。

为探究胚胎基因组激活之前母源基因组对早期胚胎发育的调控，陈富美[47]通过scRNA-seq技术对体外孤雌激活水牛卵母细胞(GV、MⅡ)和孤雌生殖早期胚胎(2-细胞、4-细胞、8-细胞、16-细胞、桑葚胚和囊胚)进行检测，通过构建水牛附植前胚胎发育过程中母源基因组的动态转录组图谱，最终在母源基因组调控表达的基因网络中鉴定了1 530个关键基因，这些母源关键基因有助于后续研究母源基因组对水牛早期胚胎发育的调控；早期胚胎发育过程中母源基因组向合子基因组转变之后，牛胚胎处于主要的合子基因组激活时期(8-细胞至16-细胞)，应用scRNA-seq技术可在单细胞转录组水平上分析此时期滋养层细胞、外胚细胞和原始内胚层3种细胞谱系形成的机制，进一步确定合子基因组激活的时间和研究卵裂球发育的异质性。ILARIA等[48]利用scRNA-seq技术对14个体外生产2～3 d的牛胚胎的161个卵裂球进行检测，揭示了此时期胚胎中细胞转录组的异质性和卵裂球的非同步发育。为探明绵羊IVF受精卵母源基因组向合子基因组转变和卵裂球致密化过程中的差异表达基因的功能和相关代谢通路，李娜[49]对绵羊体外受精8-细胞、16-细胞和桑葚胚进行scRNA-seq检测，通过分析3个阶段差异表达基因富集的功能和代谢通路，发现8-细胞与16-细胞差异表达基因显著富集在癌症中转录失调和Hippo等信号通路；16-细胞与桑葚胚差异表达基因显著富集在剪接体组装和调控干细胞多能性代谢通路。为后续绵羊早期胚胎差异表达基因表征性分析提供理论依据。

3.3 繁殖力卵膜蛋白JUNO和精子表面IZUMO1蛋白是第一对被发现的对精卵融合至关重要的受体-配体蛋白对，IZUMO1和JUNO识别的敏感性会影响到精子与卵母细胞识别的效率，总体影响哺乳动物的繁殖力[50]。为探究绵羊JUNO基因与产仔数之间的关系，HU等[50]对小尾寒羊单多羔群体JUNO基因进行单核苷酸多态性(SNP)检测，随后通过scRNA-seq分别分析多羔和单羔小尾寒羊卵母细胞、卵巢颗粒细胞和卵泡膜中的特异性表达基因，结果表明，JUNO在卵母细胞中特异性表达，但在颗粒细胞和卵泡膜中不表达，这与其在受精过程中作为受体的功能一致，同时，多羔和单羔小尾寒羊卵母细胞中JUNO的表达没有差异，表明JUNO的表达与产仔性状无关。此外，scRNA-seq数据还显示BMP15和GDF9在卵母细胞中特异性表达，BMPR1B和CD9在颗粒细胞和卵泡膜中特异性表达，结果支持BMPR1B、BMP15和GDF9在以往研究中被确认为绵羊产羔数的主要调节基因[51]，卵母细胞产生的GDF9和BMP15与位于颗粒细胞上的BMPR1B受体结合，共同刺激颗粒细胞的增殖[52]，为后续研究绵羊产羔数的调控机制提供理论依据。

卵泡发育进程中卵巢颗粒细胞(granulosa cells，GCs)与卵母细胞通过缝隙连接和旁分泌信号通路相互交流形成卵母细胞发育的微环境[53]，分析GCs的转录组有助于寻找影响卵泡发育的因素和评估卵母细胞以及后续的胚胎质量，从而提高家畜的繁殖力[54]。为揭示山羊GCs在不同发育阶段的基因表达和不同繁殖力山羊GCs的特征，LI等[55]分别对高产仔数(high little size，HL；≥2/L)和低产仔数(low litter size，LL；≥2/L)济宁青山羊2个群体不同阶段(早期、生长期和晚期)卵泡GCs进行scRNA-seq，发现在2个群体的3个卵泡发育阶段基因表达差异主要集中在早期和晚期，早期HL-GCs与LL-GCs差异表达基因显著富集在细胞周期、有丝分裂、G2/M转换和细胞凋亡调控等相关通路上，晚期HL-GCs与LL-GCs差异表达基因显著富集在线粒体活性、氧化反应、自噬和蛋白质定位相关通路上，scRNAseq结果表明相对于低繁殖力组，高繁殖力组GCs有更大的调节能力来支持卵母细胞发育，使得卵母细胞有更好的发育潜力。同时，LI等[55]鉴定了在不同发育阶段差异表达的标记基因，在后续研究中可作为山羊卵泡GCs发育的参考基因。

3.4 肌肉发育骨骼肌作为家畜运动系统的主要组成部分以及畜牧生产中肉品质的重要决定因素，探究影响骨骼肌发育的研究对畜牧业生产有重要意义，而骨骼肌发育是由遗传和表观遗传多方面调控的复杂生物学过程。m6A(N6-methyladenosine)是真核生物mRNA最常见的一种转录后表观遗传修饰形式，参与调控包括骨骼肌发育等在内的众多生物学过程。为探究m6A猪胚胎期和出生后骨骼肌发育中的调控作用，张鑫鑫[56]通过scRNA-seq技术利用单细胞转录组文库构建的重要方法——SMART2获得了长白猪胚胎期6个时间点和出生后4个时间点骨骼肌中全转录组m6A单细胞图谱，随后通过免疫共沉淀技术筛选了m6A在猪胚胎期和出生后骨骼肌发育中调控的关键基因，为全面认识骨骼肌发育调控网络提供重要证据，同时建立了适用于微量样本全转录组m6A图谱绘制方法R-MeRIP，解决了m6A 研究中骨骼肌样本量不足的问题。

骨骼肌中肌细胞和脂肪细胞共同起源于间充质干细胞[57]。肌肉间充质干细胞经过系谱定向成为成肌细胞和成脂细胞，经过进一步分化形成肌细胞和脂肪细胞，而间充质干细胞的转录组信息作为内源因素来影响其系谱定向[58]。KAI等[59]分别对莱芜猪与约克夏猪最后一根肋骨处背最长肌肌源细胞进行scRNA-seq检测，结果表明，与脂肪型猪相比，瘦肉型猪的骨骼肌中保留了更高比例的肌肉谱系细胞，瘦肉型猪的骨骼肌特征是建立在肌生成上，其肌谱系细胞更接近肌源性祖细胞的原始阶段，这意味着肌谱系细胞的分化阶段决定了骨骼肌的肌发生能力，越接近肌发生谱系的初始阶段，肌肉发育越强，异位脂质沉积越少。

3.5 营养代谢调控幼龄反刍动物的瘤胃上皮生理和代谢功能发育都不完全，尚未表现出高度角质化特征[60]。有研究表明丁酸对瘤胃上皮发育的刺激作用最大[61-62]。在饲料中添加合适浓度的丁酸能促进幼龄反刍动物瘤胃上皮发育，该过程与瘤胃上皮细胞快速增殖密切相关，但以往的研究不足以阐明丁酸促进瘤胃上皮发育的深层机制。LIN等[63]通过体外建立了2周龄犊牛瘤胃上皮细胞的原代细胞，利用scRNA-seq技术分析了瘤胃原代上皮细胞的转录组，结合体外丁酸盐处理细胞试验，鉴定了受丁酸盐影响的差异表达基因，结果支持丁酸盐在调节影响瘤胃发育的基因组和表观基因组活动中起中心作用，同时鉴定了与瘤胃生长和发育相关的基因和基因调控网络，为进一步研究丁酸盐诱导的瘤胃上皮细胞染色质动力学提供理论基础。

绒山羊羊毛的生长具有明显的周期性变化，分别为休止期、生长期和退行期，其生长主要由次级毛囊的生长控制，而次级毛囊的生长周期是由于毛囊结构中不同类型的毛囊干细胞不断地增殖或分化实现的。为探究不同种类毛囊干细胞内蒙古绒山羊毛囊周期生长的调控机制，杨峰[64]通过scRNA-seq检测内蒙古绒山羊休止期(3月)、生长期(9月)和退行期(12月)背部皮肤细胞共获得了7 000个细胞转录本信息，GO注释及KEGG信号通路分析构建毛囊周期转变的细胞分化轨迹及其相关信号通路，进一步说明黑素细胞调控整个毛囊周期，研究认为黑素细胞接收信号并分泌黑素可能是导致毛囊由休止期进入生长期的标志，为进一步研究内蒙古绒山羊的皮肤毛囊周期性变化机制奠定基础。

与其他细胞相比，猪卵母细胞和植入前胚胎中含有较多脂质，脂质可以在植入前胚胎发育过程作为能量来影响生物膜的特性和功能，在细胞间的相互作用以及细胞间和细胞内能量代谢与物质转运中发挥着重要作用[65-66]。研究表明脂肪酸影响正常的卵母细胞成熟和后续的胚胎发育[67-68]，为探索脂肪酸代谢在猪体外胚胎中的相关作用机制，刘芳[69]通过scRNA-seq检测体外培养不同阶段猪的孤雌激活胚胎和IVF胚胎，揭示了调节猪植入前胚胎发育的脂代谢分子基因调控网络。

4 小结与展望

scRNA-seq技术的发展有助于研究人员获取单个细胞表达谱进而检测细胞组分的变化。目前，scRNA-seq在家畜研究中主要集于动物生殖发育领域，scRNA-seq在家畜配子发生、早期胚胎发育、机体发育和机体代谢等方面的相关研究对于发挥优良种畜的繁殖潜力有重要的意义；同时，scRNA-seq对于研究动物免疫细胞的特异性免疫应答和制定有效的疾病治疗与预防方案有很大的潜力。由此可见，随着scRNA-seq技术的发展及其在家畜研究中的不断深入，家畜育种、疾病治疗和预防、营养代谢和机体发育等方面的相关研究必将会取得更加丰硕的成果。