穴位注射温敏水凝胶对坐骨神经痛大鼠的效果及应用

2022-03-05 06:44卫弯姚勇杨华元
中医药信息 2022年2期
关键词:造模脊髓凝胶

卫弯,姚勇,杨华元

(上海中医药大学,上海 201203)

羊肠线是临床上最常用的穴位埋线材料之一,具有一定的治疗作用,但存在功能单一、埋植工具成本高、部分患者对其过敏等问题[1-2]。具有三维网络结构的水凝胶材料因其良好的生物相容性、生物可降解性、可注射性以及药物缓释作用,已逐渐成为穴位埋植材料的首选之一[3-4]。本研究从生物相容性良好的可注射CS/GP 水凝胶在室温下呈液态、37 ℃下可固化的特点出发,同时装载地塞米松(DXM),不仅可以通过使药物缓释以减少直接给药的副作用,注射后还可以通过溶胶-凝胶转变的方式粘附于穴位进行持久刺激。基于此,本研究通过比较其与羊肠线埋线法对坐骨神经痛大鼠的治疗效果,挖掘其镇痛机制,并探索其是否可作为穴位埋线的替代材料。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用健康清洁级SD 大鼠,体质量(200±20)g,购于上海中医药大学,动物许可证号:SCXK(沪)2018-0006。饲养在上海中医药大学实验技术中心,饲养条件为光照周期12 h/12 h,室温22~25 ℃,相对湿度45%~60%。大鼠自由进食、饮水,整个实验过程遵照中华人民共和国科技部2016年颁布的《有关动物的使用及伦理学规定》。

1.2 主要仪器和试剂

壳聚糖(CS,货号:C105799,中国上海阿拉丁公司);盐酸溶液(批号:10011028,国药集团);β-甘油磷酸酯(β-GP,批号:D106347,上海阿拉丁科技有限公司);DXM(货号:60231A,Adamas);水浴锅(HH-S单孔,长城);大鼠ELISA 试剂盒TNF-α(批号:xy-E1275,上海信裕生物科技有限公司);大鼠ELISA试剂盒IL-1β(批号:xy-E12689,上海信裕生物科技有限公司);兔抗Iba1 抗体(货号:#17198,CST);羊抗P2X4R 抗体(货号:ab134559,Abcam);2450 型爪痛觉测试仪(美国IITC Life Science 公司);荧光显微镜(ECLIPSE Ni,NIKON公司)。

1.3 水凝胶的制备

在连续磁力搅拌下,将CS(200 mg,脱乙酰度为90%~95%,分子量中等)中加入盐酸溶液(配制浓度0.1 mol/L,10 mL)2 h,随后在连续搅拌下逐滴加入β-GP 溶液(56% W/V,2 mL)。将DXM(12 mg)溶解在上述CS/GP溶液中。

1.4 分组、造模与干预

将40 只健康雄性SD 大鼠随机分为对照组(Control 组)、模型组(CCI 组)、羊肠线埋植组(Catgut组)、CS/GP 组和CS/GP/DXM 组,每组各8 只。除Control组外,对其余组大鼠进行CCI造模。

CCI 大鼠模型的建立:SD 大鼠于造模前1 d 禁食、禁水,腹腔麻醉(0.3% 戊巴比妥钠,给药剂量为1 mL/100 g)。麻醉成功后,在大鼠右腿后侧中部进行消毒,铺无菌巾,切开皮肤约2 cm,钝性分离股二头肌,暴露右坐骨神经中段。用4-0丝线松散结扎4次,每次结扎间隔1 mm,松紧度以结扎丝线能在坐骨神经干上滑动,大鼠肌肉轻微颤动为宜。密切观察大鼠的生命体征和伤口愈合情况。

造模完成后,CS/GP 组和CS/GP/DXM 组分别在足三里(ST36)穴处注射0.1 mL 相应水凝胶,Catgut 组在足三里穴处埋植2 mm 左右羊肠线。各治疗组均每周进行1次治疗。

1.5 检测指标

1.5.1 温敏性实验

水凝胶的温敏性通过玻璃瓶倒置方法进行测试,控制温度在37 ℃左右时进行,将玻璃瓶倾斜放置30 s后,若溶液不再流动,意味着溶液已完全转化为凝胶。

1.5.2 生物相容性

将12 只雄性SD 大鼠随机分为对照组(PBS 组)、CS/GP 组与CS/GP/DXM 组,每组各4 只。对照组大鼠在第7 颈椎的椎体处(颈部和背部的交界处)皮下注射200 µL 的PBS;CS/GP 组与CS/GP/DXM 组大鼠在与阴性对照组相同的解剖部位注射200µL 相应的水凝胶。2 周后取注射处皮肤组织,在4%的聚甲醛(PFA)中固定2 d,在一系列乙醇中脱水后,嵌入石蜡中,切3 µm的厚片,然后进行HE 染色,通过HE 染色评价水凝胶的相容性。

1.5.3 行为学评价

机械刺激缩足反射阈值(PMWT)测定:术前和术后第1、3、5、7、10、14 天用电子Von Frey 痛觉测试仪测量SD 大鼠的右后爪痛觉。将大鼠放在笼子里30 min,当大鼠安静时,逐渐对手术侧的脚底施加压力,直到出现抬脚、避让或舔脚等动作。记录出现阳性反应时施加在脚底的最大压力,并以5 min 为间隔重复测量3次。

1.5.4 ELISA检测方法

采用ELISA 法检测大鼠血清中TNF-α 与IL-1β的表达。术后第14 天对大鼠进行麻醉,钝性分离组织器官,暴露腹主动脉,从腹主动脉采集5 mL 血液,4 ℃下3 000 r/min 离心15 min,用吸管吸出上清液。严格按照ELISA试剂盒说明书进行测定。

1.5.5 免疫荧光技术检测脊髓L4~L6背角的Iba1 及P2X4R的表达量

术后第14 天对大鼠进行麻醉后取材,取材部位为L4~L6脊髓节段,多聚甲醛中固定2 h 后,在含有25%蔗糖的0.1 mmol/L PBS 中保存48 h,在冷冻切片机上切片。室温封闭1 h 后,分别加入稀释浓度为1∶1 000的一抗(Iba1 与P2X4R),4 ℃下15 h 后,将切片用0.01 mol/L PBS 洗3 次,滴加二抗与显色剂,于显微镜下观察。

1.6 统计学方法

所有实验数据均使用SPSS 26.0 软件进行统计学分析,并使用GraphPad Prism 5.01 绘图。采用双变量方差分析和邦弗朗尼Bonferroni 事后检验比较各组在不同时间点的PMWT;采用单因素方差分析对各组生化指标进行比较。数据以均数±标准差(±s)表示,以P<0.05代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 水凝胶的温敏性实验结果

温敏性实验结果表明,CS/GP 在室温下为淡黄色透明液体,流动性好,液面随试管的倾斜而变化,溶液状态有利于它的可注射性;在37 ℃以上的水浴中加热5 min 后,CS/GP 液体迅速转变为凝胶状固体,附着在试管壁上,呈淡黄色,性质均匀,浑浊不透明,试管倾斜时凝胶固定,失去流动性,注射于穴位后可以凝固成胶状粘附于穴位,达到长时程刺激穴位的作用。见图1。

2.2 水凝胶生物相容性结果

CS/GP 和CS/GP/DXM 水凝胶注射在SD 大鼠体内后并未发生挤压变形等情况,且在皮肤组织下很好地形成了胶体。SD 大鼠的生理温度约为37 ℃,可以清楚地观察到,水凝胶可在其背部皮肤上形成凝胶,失去流动性,并与周围组织粘连,而且没有观察到局部发红、肿胀或坏死等炎症反应,可以实现对穴位的持续长时间刺激,见图2 a1~a3。HE染色发现,水凝胶在大鼠皮下与周围组织有良好的分界和固定性,见图2 b1~b3。在水凝胶注射部位周围的皮肤组织中可以观察到清晰的界限。结果表明水凝胶具有良好的生物相容性,可用作穴位埋植的可替代材料之一。

2.3 各组大鼠PMWT结果比较

各组大鼠造模前PMWT 的基础测量值并无差异。单侧坐骨神经结扎后,CCI 组大鼠在1 d 内同侧后爪出现明显的痛觉过敏,并持续了约14 d。而Control组同侧后爪的PMWT 可以保持稳定14 d。注射CS/GP/DXM 水凝胶后第1 天,大鼠的PMWT 即开始增加,并在14 d 内有明显改善。此外,在第1 天治疗后到第14 天治疗结束时,与CCI 组、Catgut 组比较,在这些不同的治疗时间点上CS/GP/DXM 组的PMWT 均明显提高(P<0.001),而CS/GP 组和CCI 组差异无统计学意义。结果表明载药水凝胶在一定治疗剂量范围内可以明显缓解CCI 大鼠的痛敏情况。见表1和图3。

表1 各组大鼠治疗后PMWT结果比较(±s,g)

表1 各组大鼠治疗后PMWT结果比较(±s,g)

注:与CCI组比较,***P <0.001;与Catgut组比较,&&&P <0.001。

组别Control组CCI组Catgut组CS/GP组CS/GP/DXM组造模前49.73±2.34 47.59±4.10 49.35±5.37 46.93±5.32 50.27±3.73术后第1天46.55±4.05 19.86±1.50 22.48±2.19 20.30±1.61 36.12±2.32***&&&术后第3天48.78±3.80 17.67±1.13 21.99±1.78 19.92±1.31 33.00±2.23***&&&术后第5天44.46±2.83 16.78±1.91 22.85±2.31 19.22±2.45 33.07±2.06***&&&术后第7天47.22±4.20 15.84±1.85 23.04±2.27 19.13±2.13 34.55±2.29***&&&术后第10天46.51±3.11 17.26±1.92 22.75±2.08 18.05±1.87 36.59±4.63***&&&术后第14天48.06±4.00 17.38±1.89 24.94±2.88 18.68±3.23 38.65±2.32***&&&

2.4 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β表达情况比较

与对照组比较,CCI 组和CS/GP 组大鼠血清中TNF-α 和IL-1β 的表达明显增加(P<0.001)。与CCI 组和CS/GP 组比较,Catgut 组TNF-α 和IL-1β的表达水平下降(P<0.001,P<0.01)。与CCI 组比较,CS/GP/DXM 组大鼠血清中TNF-α 与IL-1β的表达明显降低(P<0.001),且低于Catgut 组(分别为P= 0.049,P= 0.013)。结果表明,CS/GP/DXM水凝胶在持续的药物释放下,可通过降低血清中TNF-α、IL-1β 的表达水平来抑制神经性疼痛的全身免疫反应,其效果优于没有载药的Catgut 组。见表2。

表2 各组大鼠治疗后血清中TNF-α、IL-1β比较(±s,ng/L)

表2 各组大鼠治疗后血清中TNF-α、IL-1β比较(±s,ng/L)

注:与Control 组比较,***P <0.001;与CCI 组比较,##P <0.01,###P <0.001;与CS/GP 组比较,&&P <0.01,&&&P <0.001;与Catgut 组比较,△P <0.05。

组别Control组CCI组CS/GP组Catgut组CS/GP/DXM组n4 4 4 4 4 TNF-α 81.28±14.84 154.69±8.19***141.11±11.87***99.50±11.56&&&###81.39±9.72&&&###△IL-1β 9.40±1.55 20.02±2.15***19.65±2.65***14.31±1.54&&##10.56±0.82&&&###△

2.5 各组大鼠脊髓L4~L6背角Iba1 及P2X4R 表达量比较

与对照组比较,CCI 模型后SD 大鼠脊髓背角上P2X4R+以及Iba1+细胞数明显增加。经CS/GP/DXM水凝胶注射治疗2 周后,大鼠脊髓背角P2X4R 表达减少;与Catgut 组比较,Iba1+小胶质细胞数量被明显抑制。见图4。

3 讨论

本次研究中制作的两种可注射的CS/GP 水凝胶和CS/GP/DXM 水凝胶均具有良好的生物相容性、可注射性、温敏性以及可载药性,优于功能单一的羊肠线。结果显示,CS/GP/DXM水凝胶可通过降低血清中TNF-α、IL-1β 的表达水平、抑制脊髓背角上小胶质细胞的活化以及P2X4R 的表达而发挥其镇痛作用,且治疗效果优于羊肠线。

温敏性水凝胶的优点是制备方法简单,且不需要进行手术,常温下(25 ℃)水凝胶呈溶液状态,具有可注射性,在接近人体生理温度下(37 ℃)即可成胶,降解时间较长,可在一定程度上改善传统羊肠线埋线治疗方式,减少埋植次数,降低成本。此外,可注射水凝胶的剂量便于控制,疗效肯定,在穴位埋线疗法的材料选择中具有很大的应用前景。壳聚糖是一种被广泛研究的多糖,甘油磷酸酯(GP)的加入能使其成为热敏性水凝胶,实现溶胶-凝胶的转变[5]。这种水凝胶可以通过简单的混合得到,而且与周围的组织能很好地相容,对临床治疗有一定的参考价值。穴位埋线疗法在临床治疗中的应用广泛,如治疗各种急慢性及难治性疾病,这种疗法与普通针灸比较,具有刺激持久、治疗次数少、依从性好等优点[2]。羊肠线是临床上最常用的埋植材料,目前仍有部分患者对羊肠线过敏,因此其他高分子材料的开发和应用具有很大潜力[6-7]。研究表明,穴位注射壳聚糖线被人体吸收后,能够对穴位及周围组织产生较长时间的生理、生化反应,可达20日或以上[8]。因其可降解性缓慢,注射水凝胶治疗能减少穴位埋植次数,简化操作,同时,其载药性还能增强治疗作用,采用这种可注射水凝胶进行治疗不仅能改进埋线工具、减少患者的痛苦,还可以降低治疗成本。

CCI 模型是常见的神经病理性疼痛动物模型,神经结扎2 周后,CCI 大鼠表现出自发性疼痛、热敏痛和机械热敏痛,疼痛高峰约在第14 天,因此CCI 模型是模拟慢性神经病理痛症状的最佳模型[9],而足三里穴(ST36)是治疗坐骨神经痛的重要穴位[10-12],故在本研究中被采用。研究结果表明,装载DXM 的CS/GP 水凝胶在ST36 处注射后可显著提高CCI 大鼠的PMWT,减少痛敏现象。

IL-1β 和TNF-α 是核转录因子-κB(NF-κB)信号通路中的重要因子,在炎症反应中首先表达,并在促进炎症发展中发挥重要作用[13]。本研究观察到CCI组大鼠血清中TNF-α、IL-1β 显著增加,而与CCI 组比较,CS/GP/DXM 组大鼠血清中TNF-α 与IL-1β 的表达明显降低,表明载有控释药物的CS/GP/DXM 水凝胶可以通过长时间刺激穴位起到抗炎镇痛的作用。此外,本研究通过观察脊髓背角上小胶质细胞及P2X4R 的表达量,进一步探索可注射CS/GP/DXM 水凝胶可能的镇痛机制。周围神经损伤后,脊髓背角小胶质细胞的激活及其表面P2X4R 的表达对痛觉的维持有重要作用[14-15],阻断小胶质细胞中P2X4R 的表达可能是治疗神经病理性疼痛的新策略[16]。对于神经病理性疼痛的分子机制研究也发现,神经损伤后P2X4R会迅速在脊髓中大量表达[17]。本次研究结果表明,装载DXM 的CS/GP 水凝胶能够抑制CCI 大鼠脊髓背角上小胶质细胞的活化以及P2X4R 的表达,具有良好的镇痛效果。

总之,装载DXM 的CS/GP 水凝胶因其良好的生物相容性、可注射性、温敏性以及对药物的缓释作用,在对CCI 大鼠的穴位埋植治疗中具有一定的优势,可用作一种新型穴位埋植材料,在治疗神经性疼痛中具有很大前景。今后本团队还需对其在体内治疗的作用做进一步考察,以明确本疗法的临床应用前景。

猜你喜欢
造模脊髓凝胶
人工3D脊髓能帮助瘫痪者重新行走?
脊髓电刺激新技术让瘫痪患者恢复运动能力
猕猴脊髓损伤康复训练装置的研制
PPAR-γ在三硝基苯磺酸诱导的肠纤维化模型小鼠结肠中的动态表达特点
蛋鸡输卵管炎造模方法的筛选与验证
纤维素气凝胶的制备与应用研究进展
超轻航天材料——气凝胶
消夏凝胶弹机
SD大鼠哮喘模型建立方法及评价的比较研究
新型避孕凝胶,涂在肩膀上就可以避孕?