陕西地区下颌前突患儿相关基因筛选及GHR基因多态性相关分析研究

汪瑞芳，伍宗辉，冯国维，李亚奇，宋佳凝，杨相笛(西安市儿童医院口腔科，西安 710002)

下颌前突是儿科常见的颌面部发育畸形疾病，研究结果显示下颌前突占正畸矫正治疗患者的比例高达20.80%[1]。下颌前突不仅影响儿童成年后正常咀嚼和发音功能，还损害颌面部形象，给儿童造成沉重的心理负担，影响正常家庭生活，成为引发各种社会问题的潜在诱因。目前已有研究指出生长激素受体(growth hormone receptor,GHR)的基因多态性与下颌的发育生长显著关联，但仍缺乏较系统的研究[2-4]。本研究选取陕西地区下颌前突患儿为观察组，同期健康儿童为对照组，利用基因表达数据库(gene expression omnibus,GEO)，采用生物信息技术筛选差异表达基因，并分析核心基因的基因多态性，以探讨陕西地区下颌前突患儿基因分型特点和基因突变位点，为临床早期预防和治疗下颌前突提供合理依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2018年5月～2020年5月西安市儿童医院口腔科收治的112 例陕西地区下颌前突患儿为观察组，男性74 例，女性38 例；年龄7.62±3.38 岁，体重指数15.01±0.49kg/m2。另选取同期112 例健康儿童为对照组，其中男性68 例，女性44 例；年龄7.43±3.21 岁，体重指数14.96±0.63kg/m2。两组一般资料比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

纳入标准：①下颌前突临床可见面下1/3 向前突出，下唇外翻，上下唇不能闭合；②年龄≤12 岁。

排除标准：①并发唇腭裂或颞下颌关节病者；②并发口腔软组织损伤者；③并发有龋齿、口腔黏膜病；④并发有运动神经元病、周围神经病者；⑤陕西籍以外儿童。

1.2 仪器与试剂 Agencourt RNACleanXP 型DNA提取试剂盒(贝克曼库尔特商贸有限公司)，Alpha-1900S 型双光束紫外可见分光光度计(上海谱元仪器有限公司)，酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒（上海晶抗生物工程有限公司）。

1.3 方法 数据集采集：通过GEO数据库收集数据，在GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)中搜索关键词“mandibular protrusion”，“pathogenic gene”，纳入标准：数据集为全基因组表达mRNA 芯片数据，排除标准：①没有健康人群作对照的数据集；②患者经历药物干预、基因敲除或过表达操作；③样本来自于非人的模式生物组织。选择与下颌前突相关的一个数据集GSE38494，包括下颌前突和配对下颌正常儿童基因芯片的数据集。

差异表达基因筛选和分析：采用BRB-Array Tools 中的RMA 法对原始数据进行标准化处理，以Benjamini-Hochberg 对数据进行校正，确定差异表达基因：①基因表达差异倍数的对数的绝对值log2FCl＞1.0；②P＜0.05。采用R 包软件中的limma工具分析标准化处理后的基因表达谱数据，并采用贝叶斯法进行多重检验，筛选差异表达倍数＞1.0 倍的基因。采用DAVID 数据库，在线对差异表达基因行基因本体论(gene ontology，GO)功能注释。并利用京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)对基因行通路富集分析。

蛋白- 蛋白互作分析(protein-protein interaction，PPI)：采用STRING 数据库对差异表达基因进行分析，构建陕西地区儿童下颌前突发病相关基因的PPI 网络，以combined score ＞0.4 为筛选条件。采用cytoscape 软件和Mocde 插件行可视化和节点分析，以插入式分子复合物检测(molecular complex detection，MCODE)筛选PPI 网络中的关键基因，筛选条件：MCODE 评分＞4 分，节点数＞5 个。得到网络中心节点(Hub Node)，以Hub Node 对应的基因为核心基因。再采用CytoHubba 插件计算基因的最大团中心性(maximal clique centrality，MCC)得分，记录得分前10 位的关键基因，并将得分最高的基因作为下一步基因多态性检测的指标。

GHR基因多态性检测：在国际人类基因组单体型图和美国国立生物信息中心(National center for biotechnology information，NCBI)的SNP 数据库中选择基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)，选择最小等位基因频率≥10%的SNPs。取观察组和对照组儿童肘静脉血3.0 ml，采用DNA 提取试剂盒提取总DNA，测定DNA 浓度和纯度。采用Mass Array 平台对样本SNPs 进行分析，记录GHR基因分型。PCR 引物设计参照NCBI 人类基因组序列，见表1。

表1 PCR 引物设计

血清GH水平检测方法：取观察组和对照组儿童肘静脉血3.0 ml，离心后取血清液，冷冻备用。采用ELISA 检测血清GH水平，具体操作按试剂盒说明进行。

1.4 统计学分析 选用SPSS 20.0 软件对数据进行统计学分析，基因型和基因频率分布行Hardy-Weinberg 平衡检验，P＞0.01 为符合Hardy-Weinberg遗传平衡法则，采用Class comparison 进行分类比较，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间行t检验，计数资料以频数(频率)表示，组间行χ2检验，以比值比(odds ratio，OR)表示等位基因关联强度，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 下颌前突患儿差异表达基因筛选结果 采用BRB-Array Tools 软件对芯片数据进行标准化处理。分类比较在数据集GSE38494 中发现差异基因共328 个，其中上调基因102 个，下调基因226个，差异表达基因的火山图见图1。差异表达基因中MCC 评分前10 位的基因依次为GHR，JAK3，STAT3，INS，IRS1，IGF1R，PRL，PTPN11，GH1 和SOCS3 且均为上调，聚类热图见图2。

图2 差异表达基因的聚类热图

2.2 PPI 分析结果 见图3。PPI 分析结果显示，GHR，JAK3，STAT3，INS 及IRS1 与其他蛋白作用关系紧密，其中以GHR 最为突出，是下颌前突患儿致病的关键核心基因，作为基因多态性分析的目标基因，作为下一步多态性分析指标。GO 富集和KEGG 分析显示差异表达基因参与信号通路、内分泌失调、炎性反应、免疫反应及细胞因子活性，见表2。

图3 PPI 分析

2.3 GHR基因多态性分析 两组儿童GHR基因SNPrs1673 位点的基因型频率和等位基因频率比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。观察组GHR rs1673 等位基因C 频率较对照组显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05)，下颌前突发病风险显著增加(95%CI=1.394～3.084，OR=1.726)。两组儿童GHR基因SNPrs4130113，SNPrs4410646，SNPrs4866949，SNPrs61150458 及SNPrs6898743位点基因型和等位基因分布比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表3 GHR基因多态性分析

2.4 两组血清GH水平的比较 观察组患儿血清GH水平为7.18±2.26ng/ml，显著高于对照组4.50±1.17 ng/ml，差异具有统计学意义(t=11.145，P＜0.001)。

3 讨论

下颌前突的家族聚集性特征已成为临床共识，因而遗传因素与下颌前突的关系逐渐引起临床重视[5]。基于基因组学水平的分析不仅有助于从分子层面揭示下颌前突的成因，对指导临床进行早期防治也具有重要意义。多基因遗传是由两对及以上致病基因累积效应引起的遗传模式[6]，CASTELLANOS等[7]研究发现HSPG2 和MATN1基因可能是下颌前突的致病基因，SUGIME 等[8]则认为HOX基因突变使下颌前突风险显著增加。研究还表明，COLCA1 表达水平与下颌骨生长有显著相关性，其rs1793953 位点是下颌前突的保护因素[9]。因而，下颌前突属多基因遗传病。目前，有关下颌前突多基因遗传尚处于探索阶段，但随着生物基因芯片技术的发展，有关下颌前突致病基因的数据被传至数据库[10]，这为下颌前突发病机制的探讨提供新的途径。

本研究以GEO 为平台，采用生物信息法获取数据集，对下颌前突的相关基因进行筛选，并对差异表达基因进行GO 富集和PPI 分析，结果显示GHR 处于蛋白质相互作用的核心位置，其MCC 评分与基因差异倍数最高，提示GHR 在下颌前突患儿发病中可能起到关键作用。GHR 定位于染色体5p12-13.1，存在多个磷酸化位点，参与软骨分化生长、信号通路激活及分子功能，其生物学功能活跃，是儿童生长激素重要的信号传递中介，因而GHR与机体生长发育密切相关。本研究还证实GHR 和JAK3，STAT3，INS，IRS1，PRL，PTPN11，GH1及SOCS3 等蛋白存在蛋白相互作用，这有助于介导其他生理功能，参与细胞外基质结合、成骨细胞分化过程，影响下颌骨发育。但有研究显示GHR mRNA 在不同发育阶段、不同地域儿童中表达水平差异显著[11]，提示GHR 可能存在特异性。GHR 通过与GH 结合，可介导BMP-Smad，JAK2/STAT3等信号通路，参与各种生物学行为。而一旦GHR基因发生突变，则可能引起GHR 细胞外功能障碍，进而破坏正常信号传导，影响软骨正常生长发育，增加下颌前突的易感性。PPI 分析结果也显示GHR基因是下颌前突相关蛋白相互作用网络中的核心蛋白，提示GHR基因在下颌前突患儿发病过程中可能发挥重要作用。本研究对比西安市儿童医院两组儿童血清GHR水平，以验证GHR 在下颌前突致病中的作用，结果也显示观察组患儿血清GHR 显著高于对照组儿童，这一结果说明血清GHR水平异常表达可能是陕西地区儿童下颌前突的致病因素。但目前有关GHR基因多态性在国内外也存在争议，提示GHR基因在下颌前突发病中的作用可能有地域差异。

为进一步明确GHR基因突变位点，本研究对两组儿童GHR基因进行多态性分析，结果显示在GHR基因6 个标签SNPs 中，仅发现rs1673 位点基因型和等位基因分布差异有统计学意义，说明陕西地区儿童下颌前突发病可能与GHR基因SNP1673位点突变有关。在该位点上，碱基发生由A→C 的突变，引起GHR基因编码发生蛋白一级结构改变，造成生物学功能障碍，影响细胞内生长信号传递，导致成骨细胞分化异常，诱发下颌前突的发生。张磊等[12]认为基因碱基由A→C 突变可通过影响细胞生长信号通路传导进而引起GH-胰岛素样生长因子功能轴的异常改变，影响软骨细胞分化和增殖，最终造成下颌前突。薛凡等[13]还发现香港地区下颌前突患者GHR基因SNP 位点rs6898743基因型和等位基因分布差异有统计学意义，而本研究并未见此差异，这一结果也提示下颌前突可能存在地域差异和遗传异质性。但下颌前突作为多基因遗传病，GHR基因是否与其他基因间存在累积效应，GHR与其他基因间的协同作用是否增加疾病发生机率仍有待今后深入研究。

综上，陕西地区下颌前突患儿发病与多个基因的差异表达有关，参与信号通路传导，其中GHR基因SNP 位点rs1673 与下颌前突关联性强。