创伤性颅脑损伤患者血清miR-422a，miR-212-5p表达水平与病情和预后的相关性研究

赵大龙，田金灵（菏泽市中医医院医学检验科，山东菏泽 274000）

颅脑损伤是施加于头部的机械力引起的脑形态改变或神经功能破坏，是创伤患者中死亡率和致残率最高的类型[1]。微小核糖核酸（micro nucleic acid，miRNAs）广泛参与细胞增殖凋亡、代谢、应激、组织修复等几乎生命体各种生命活动的调节过程，在颅脑损伤以及神经组织修复中也发挥重要调节作用[2]。现有报道显示miR-422a 在急性缺血性脑卒中急性期表达上调，亚急性期表达下调[3]，在脑组织缺血再灌注过程中，miR-422a 参与神经细胞存活和凋亡的调节过程[4]。miR-212-5p 在神经元细胞中表达丰富，参与神经元增长分化、突触可塑性、记忆形成等过程，并维持神经元形态和功能[5]，现有研究显示miR-212-5p表达异常与阿尔茨海默病发生有关[6]。然而miR-422a，miR-212-5p 在颅脑损伤的报道却十分少见，为此本研究通过设计临床对照试验，检测创伤性颅脑损伤患者血清miR-422a，miR-212-5p表达特点，分析其与该疾病病情和预后的相关性，以期为临床诊治提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本研究已经获得山东省菏泽市中医医院伦理委员会批准，自2018年4月～2020年6月连续性选择菏泽市中医医院收治的173 例创伤性颅脑损伤患者（创伤组），均有明确外伤史，受伤至入院时间均不超过24h，急诊颅脑多层螺旋CT 提示存在颅内血肿或出血病灶，其中男性103 例，女性70 例，年龄31～52 岁，平均年龄44.15±6.02 岁，致伤机制：交通事故伤75 例，高空坠落伤55 例，砸伤43 例；脑损伤类型：硬膜外血肿32 例，硬膜下血肿51 例，脑内血肿47 例，蛛网膜下腔出血43例。所有患者入院后均由神经外科医生进行格拉斯哥昏迷量表（Glasgow coma Scale，GCS）评分，根据GCS 评分将患者分为轻度组（GCS 评分13～15 分，57 例），中度组（GCS 评分9～12 分，63 例）和重度组（GCS 评分3～8 分，53 例）[7]。排除标准：①脑卒中、颅内肿瘤、颅内感染；②痴呆、阿尔兹海默病、帕金森；③内分泌疾病、免疫和血液系统疾病。另选择同时段于我院门诊体检的125 例志愿者为对照组，均排除神经系统疾病，近期颅脑外伤或手术史，恶性肿瘤以及心、肺、肾等系统性疾病，男性85 例，女性40 例，年龄38～60 岁，平均年龄44.62±6.51 岁，创伤组和对照组受试者均知情本研究并签署同意书，组间年龄和性别比较均衡性良好（P＞0.05）。

1.2 仪器与试剂 TRIzol 试剂（上海朝瑞生物科技有限公司），miRNeasy Kit（德国Qiagen 公司），TaqMan miRNA 逆转录试剂盒（美国Applied Biosystems 公司），iTaq Universal SYBR Green 超混合液（美国BIO-RAD 公司），VeritiPro 实时定量PCR 仪（美国Applied Biosystems 公司）。

1.3 方法 血清miR-422a，miR-212-5p 检测：创伤组患者入院后立即（对照组体检当日）采集肘静脉血3ml 注入干燥试管，取血液凝固后的上层液离心（4℃，3 000r/min，15min，半径10cm）-80℃保存待检。RT-PCR 检测miR-422a，miR-212-5p表达：TRIzol法提取总RNA，miRNeasy Kit 纯化RNA，TaqMan miRNA 逆转录试剂盒将吸光度值A260nm/A280nm的50 ng RNA 样品转录为cDNA，加入iTaq Universal SYBR Green 超混合液，采用实时定量PCR 仪通过2-ΔΔCt方法[2-（Ct靶基因-Ct参考基因）]进行qPCR 定量测量。反应体系SYBR® Premix Ex Taq™ II（2×）12.5μl，dNTP1.6μl，Taq DNA 聚合酶1μl，上下游引物10μmol/L 各1μl，加反应缓冲液至20μl。反应条件：95℃变性10s，65℃退火20s;75℃延伸15s，做40 个循环。引物序列（由上海基康公司完成）：miR-422a 上游5’-ACTGGACTTAGGGTCAG-3’。下游5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’； miR-212-5p 上游5’- ACCTTGGCTCTAGACTGCT -3’，下游5’-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’。β-actin（内参）上游：5’-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3’，下游：5’-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3’。做3 次平行试验，2-ΔΔCt计算miR-422a 和miR-212-5p 相对表达量，取3 次平均值。

临床结局追踪：所有患者入院后立即给予心电监护、颅内压监测、亚低温治疗、脱水降颅压、营养神经、预防脑血管痉挛、维持水电解质平衡等常规治疗，通气障碍者行无创或有创机械通气、意识障碍加重、瞳孔变化者，立即复查颅脑CT，提示血肿量进行性增加达手术指征者立即急诊手术治疗。伤后30 天采用格拉斯哥预后量表（Glasgow outcome scale，GOS）[8]评估颅脑损伤患者预后情况，1 分为死亡；2 分为植物生存，仅有最小反应；3 分为严重残疾，无自我生活能力；4 分为轻度残疾，可独立生活；5 分为基本恢复良好，遗留轻度缺陷。根据GOS 评分将患者分为预后不良组（GOS 评分1～3分，62 例），预后良好组（GOS 评分4～5 分，111 例）。

1.4 统计学分析 采用SPSS 25.0 进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析（两两对比采用LSD-t检验）或独立样本t检验，性别以例(n)表示，χ2检验差异性。二元Logistic 逐步回归分析创伤性脑损伤患者预后不良的危险因素，绘制受试者工作特征曲线（ROC）分析miR-422a，miR-212-5p 诊断创伤性脑损伤患者预后的价值，以Z检验曲线下面积的差异性。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 创伤组、对照组血清miR-422a，miR-212-5p表达比较 见表1。创伤组血清miR-422a 表达高于对照组（3.02±1.02 vs 0.95±0.21），差异具有统计学意义（t=223.340,P＜0.05），miR-212-5p表达低于对照组（1.03±0.28 vs 2.85±0.61），差异具有统计学意义（t=35.544,P＜0.05）。

2.2 不同病情患者血清miR-422a，miR-212-5p表达比较 见表1。重度组血清miR-422a 表达高于中度组和轻度组，差异具有统计学意义（均P＜0.05），miR-212-5p表达低于中度组和轻度组，差异具有统计学意义（均P＜0.05），中度组血清miR-422a 表达高于轻度组，差异具有统计学意义（P＜0.05），miR-212-5p表达低于轻度组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 不同病情亚组血清miR-422a，miR-212-5p表达差异(±s，2-△△Ct）

表1 不同病情亚组血清miR-422a，miR-212-5p表达差异(±s，2-△△Ct）

项目轻度组（3）（n=57）中度组（2）（n=63）重度组（1）（n=53）F 值P 值(1)vs(2)(1)vs(3)(2)vs(3)t Pt PtP miR-422a2.21±0.12 2.92±0.66 4.01±0.13266.5410.00011.824＜0.0575.516＜0.058.000＜0.05 miR-212-5p1.27±0.04 0.97±0.25 0.84±0.06111.0280.0003.695＜0.0544.512＜0.058.953＜0.05

2.3 不同预后患者血清miR-422a，miR-212-5p表达比较 预后不良组血清miR-422a 表达高于预后良好组（4.05±0.11 vs 2.44±0.31），差异具有统计学意义（t=39.486，P＜0.05），miR-212-5p表达低于预后良好组（0.83±0.06 vs 1.14±0.21），差异具有统计学意义（t=11.354，P＜0.05）。

2.4 miR-422a，miR-212-5p 与创伤性颅脑损伤患者预后的关系 见表2。将年龄、性别（赋值：0=女，1=男），致伤机制（赋值：1=交通事故伤，2=高空坠落伤，3=砸伤），脑损伤类型（赋值：1=硬膜外血肿，2=硬膜下血肿，3=脑内血肿，4=蛛网膜下腔出血），GCS 评分，miR-422a，miR-212-5p 纳入Logistic 回归方程，向后逐步法排除无关变量（α进=0.05，α出=0.10），结果显示低GCS 评分，高miR-422a 表达，低miR-212-5p表达是创伤性颅脑损伤患者预后不良的危险因素（P＜0.05）。212-5p 预测创伤性颅脑损伤患者预后不良的界值为3.21，0.98，曲线下面积为0.797（95%CI：0.731～0.863），P=0.000，敏感度 70.97%，特异度72.07%；0.775（95%CI：0.700～0.850），P=0.000，敏感度72.58%，特异度76.58%。基于二元Logistic 计算联合miR-422a，miR-212-5p 的预测值，其曲线下面积为0.907（95%CI：0.854～0.960），P=0.000，敏感度90.32%，特异度91.89%，高于单独miR-422a，miR-212-5p 预测，差异具有统计学意义（Z=2.412，2.561，P=0.013，0.010）。

表2 影响创伤性颅脑损伤患者预后的Logistic 回归方程

2.5 miR-422a，miR-212-5p 预测创伤性颅脑损伤患者预后不良的价值分析 见图1。miR-422a，miR-

图1 miR-422a，miR-212-5p 预测创伤性颅脑损伤患者预后不良的ROC 图

3 讨论

miRNA 是受广泛关注的新型小分子非编码RNA，可调节多达30%的蛋白质编码基因的表达，并可能在许多复杂疾病的发展中发挥关键作用[9]。现有研究显示多种miRNA 可通过靶向神经病理生理途径参与颅脑外伤过程[10]。本研究发现miR-422a在创伤性脑损伤患者外周血清中表达上调，YAN等[11]人检测了创伤性脑损伤血清miRNA 谱，发现miR-422a 在轻度颅脑损伤以及严重颅脑损伤中均表达上调，提示miR-422a 可能与创伤性脑损伤病有关。miR-422a 是作用广泛的miRNA，定位于15q22.31，在脑组织中也有广泛表达，现有研究显示氧葡萄糖剥夺/再充氧可诱导脑组织中miR-422a 表达上调，并诱导神经元细胞毒性，介导神经元细胞凋亡，导致神经元细胞损伤[12]，miR-422a 在免疫介导的脱髓鞘和神经退行性疾病中也出现高表达[9]，miR-422a可作为缺血性脑卒中的生物学标志物[3]。miR-422a参与脑损伤的机制尚不清楚，可能为 miR-422a 可靶向抑制有丝分裂原激活的蛋白激酶6[13]和肌细胞增强因子2D（myocyte enhancement factor 2D，MEF2D）[14]的表达，其中MEF2D 是神经元存活所需要的关键转录因子[15]，由此可见miR-422a 过表达可能促使神经元细胞凋亡，引起病情进展。

本研究结果表明miR-212-5p 低表达与脑损伤所致昏迷程度加重以及伤后30 天神经预后不良均有关。miR-212-5p 属于miR-212 家族成员，miR-212 位于染色体17p13.3，在中枢神经系统广泛表达，参与神经元形态和功能维持，调控突触活性和认知相关基因表达[16]。miR-212 表达失调可导致认知相关信号传导通路异常，损害记忆功能[17]，miR-212 还可通过靶向脑微血管内皮细胞中紧密连接蛋白claudin-1，连接黏附分子3 和紧密连接相关蛋白1 表达破坏血脑屏障完整性[18]。推测miR-212-5p 参与创伤性脑损伤的机制为：创伤性脑损伤后缺血缺氧可诱导脑组织氧化应激反应，活性氧大量产生，抗氧化物活性降低，继而上调铁中毒相关基因表达，导致铁代谢异常，出现铁累积，最终诱导神经元变性坏死[19]。miR-212-5p 可靶向环加氧酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）（又叫PTGS2），PTGS2 是前列腺素合成的关键酶，可催化脂质氧化，诱导大量脂质活性氧异常累积，导致铁死亡（Ferroptosis）[20]，Ferroptosis 是一种铁依赖性脂质过氧化物驱使下的非细胞凋亡性死亡方式，颅脑外伤后可诱导Ferroptosis 产生[21]，因此推测miR-212-5p 可能通过miR-212-5p/ PTGS2 途径诱导Ferroptosis，继而导致神经细胞凋亡，神经功能缺损和不良结局发生。ROC 分析结果显示miR-422a，miR-212-5p 预测创伤性脑损伤患者预后不良的曲线下面积分别为0.797，0.775，而联合两项指标时曲线下面积明显扩大（0.907），提示联合检测创伤性脑损伤患者伤后24h 内血清miR-422a，miR-212-5p表达水平更有助于判断患者病情和预后，为临床提供更可靠信息。

综上所述，创伤性脑损伤患者血清miR-422a表达上调，miR-212-5p表达下调，miR-422a 过表达和miR-212-5p表达缺失与脑损伤严重程度和不良预后有关，可作为预后预测的潜在生物学指标。本研究未观察miR-422a，miR-212-5p 动态变化，两指标是否与病情变化和临床治疗反应有关尚不清楚，还需进一步研究证实。