HIV/TB并发感染患者外周血T淋巴细胞表达及与HIV RNA载量的相关性研究

李 雪，丁 艳，黄 玲，严加来（.南京中医药大学附属南京医院&南京市第二医院检验科，南京市公共卫生医疗中心，南京 0003；.安徽医学高等专科学校医学技术系，合肥 3060）

人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）感染/获得性免疫缺陷综合征（acquired immune deficiency syndrome,AIDS）（简称HIV/AIDS）和结核病（tuberculosis,TB）是全球重大公共卫生问题，近年来HIV/TB并发感染率不断增加[1]。HIV/TB并发感染时，临床症状和影像学特点均不典型，诊断困难，且易发生协同效应，使机体防御能力逐渐丧失，导致患者病情迅速恶化，死亡率极高[2]。近年来HIV/TB并发感染患者的细胞免疫功能损伤机制引起研究者的高度关注。目前国内外对TB，HIV/AIDS 及HIV/TB并发感染患者外周血T淋巴细胞亚群的研究结论不一，并且多是其中两种疾病间CD4+T 细胞计数[3-5]、CD8+T 细胞计数[6-7]、CD4+/CD8+比值[8-9]的比较，对于这三种疾病组间各指标变化特点的综合分析鲜有报道。因此本研究通过流式细胞术分析HIV/TB并发感染患者与单纯TB 患者、单纯HIV/AIDS 患者及健康人群CD3+，CD4+，CD8+T 细胞数以及CD4+/CD8+比值的变化，并分析其与HIV RNA 病毒载量的相关性，以期为临床早期诊断及疗效评估提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2018年6月～2020年6月南京市公共卫生医疗中心感染科收治并确诊为HIV/AIDS 并发TB 感染的患者38 例（HIV/TB 组），均为男性，年龄22～76 岁，平均年龄42.37±14.02岁；随机选取同期收治并确诊为单纯HIV/AIDS 患者39 例（HIV 组），均为男性，年龄18～69 岁，平均38.49±11.28 岁；单纯TB 患者35 例（TB 组），均为男性，年龄19～67岁，平均年龄45.43±14.47岁；收集同期感染科体检健康者35 例（健康对照组），均为男性，年龄19～56 岁，平均年龄34.09±11.15岁。纳入标准：①HIV/AIDS 患者诊断符合《中国艾滋病诊疗指南（2018 版）》诊断标准[10]。病例筛查HIV 抗体阳性，且均经南京市疾病预防控制中心（CDC）免疫印迹试验确证为HIV 感染，HIV RNA载量均高于检测下限。②TB 患者诊断均符合《临床诊疗指南结核病分册（2004年版）》诊断标准。均应用结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术（Gene Xpert MTB/RIF PCR）在患者体液或分泌物样本中检出结核分枝杆菌。③TB 患者和体检健康者筛查HIV 抗体均呈阴性，HIV RNA载量均低于检测下限。排除标准：①为减少性别因素误差，排除个别女性患者。②检测指标不全的患者。③使用过糖皮质激素、免疫抑制剂，或并发严重心血管病、慢性肝病、恶性肿瘤患者。本研究所采集资料均不涉及个人隐私，遵循本单位伦理规范。

1.2 仪器与试剂 FACSCalibur 流式细胞仪及配套MultitestTMCD3/CD8/CD45/CD4 试剂购自美国BD公司。COBAS AmpliPrep/TaqMan48 荧光PCR 仪及配套核酸检测试剂盒购自德国Roche 公司。

1.3 方法

1.3.1 标本采集:各研究对象于清晨空腹采集EDTA 抗凝外周静脉血2 ml 用于流式细胞检测，用带分离胶EDTA 抗凝真空管采集5 ml 外周静脉血用于HIV RNA 检测。流式细胞样本标记前室温20℃～25℃保存，标记后置于2℃～8 ℃保存。HIV RNA 样本在4 h 内3 000×g 离心15 min，吸取上层血浆备用，置于4 ℃并于72 h 内完成检测。

1.3.2 流式细胞术检测 :取出荧光抗体试剂盒室温平衡30min，采用反向加样法在绝对计数管中分别加入各研究对象的抗凝全血50 μl 充分混匀，再加入20 μl 荧光抗体试剂，涡旋混匀后室温避光15min。加入450 μl FACS 溶血素，充分混匀室温避光15min。充分混匀后上机检测CD3+，CD4+，CD8+T 细胞绝对数，以MultiSET 软件进行数据分析。CD3+，CD4+和CD8+T 细胞数参考范围分别为770～2041 cell/μl，414～1 123 cell/μl 和238～874 cell/μl；CD4+/CD8+比值参考范围为0.68～2.47。

1.3.3 荧光定量PCR 检测HIV RNA载量:使用荧光定量PCR 仪检测HIV RNA载量，按照配套核酸检测试剂盒说明书检测及结果判读。HIV RNA 检测下限为20 copies/ml。

1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0 软件进行数据统计分析，血清HIV RNA载量检测结果经对数转换后再进行数据处理。各组数据经Kolmogorov-Smirnov 检验呈非正态分布，计量资料用中位数和四分位数间距[M（P25,P75）]描述，多组间比较采用多个独立样本总体比较的Kruskal-WallisH检验。组间两两比较采用两独立样本Mann-WhitneyU检验。相关性分析采用Spearman 秩相关分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组淋巴细胞亚群结果比较 见表1。CD3+，CD4+和CD8+T 细胞数，CD4+/CD8+比值在各组中的差异均具有统计学意义（均P＜0.05），进一步进行组间两两比较，结果表明，与健康对照组相比，TB 组CD3+和CD8+T 细胞数均明显降低（Z=-2.520，-2.972，P=0.012，0.003）；HIV 组和HIV/TB 组CD3+和CD4+T 细胞数及CD4+/CD8+比值亦明显降低（Z=-7.391～-4.325，均P=0.000），差异有统计学意义。与TB 组比较，HIV 组CD3+，CD4+T 细胞数和CD4+/CD8+比值均明显降低（Z=-2.138,-7.032,-7.380,均P＜0.05），但CD8+T细胞数明显升高（Z=-2.463，P=0.014）；而HIV/TB 组CD3+和CD4+T 细胞数及CD4+/CD8+比值均明显降低（Z=-3.865，-6.907，-6.759，均P=0.000）。与HIV 组相比，HIV/TB 组各项流式指标及HIV RNA载量差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

表1 各组淋巴细胞亚群计数及HIV RNA 检测结果[M(P25,P75)]

2.2 HIV RNA载量与各淋巴细胞亚群的相关性HIV RNA载量与CD3+，CD4+，CD8+T 细胞数及CD4+/CD8+比值均呈显著负相关（r=-0.327，-0.370，-0.296 和-0.327，均P＜0.05），差异有统计学意义。

3 讨论

TB 是HIV/AIDS 最常见的机会感染，也是导致HIV/AIDS 死亡的主要原因。因此如何早期诊断和预防TB 感染是降低HIV/TB并发感染患者病死率的主要研究方向。国内外研究证实，CD4+T细胞数[11-12]和CD4+/CD8+比值[13]降低可作为一种生物标志物，用于提示HIV/AIDS 患者感染TB 的风险。本研究比较了HIV/TB并发感染患者与单纯TB 患者、单纯HIV/AIDS 患者及健康人群，结果表明CD3+，CD4+，CD8+T 细胞数和CD4+/CD8+比值在各组中的差异均有统计学意义，三组疾病中外周血T淋巴细胞表达是不同的。

TB 的致病机制尚不明确，目前研究认为CD4+T细胞在抗结核分枝杆菌的细胞免疫中发挥主导作用。本研究结果发现，相对于健康对照组，单纯TB患者的CD3+，CD8+T 细胞数明显减少，CD4+T 细胞数和CD4+/CD8+比值变化差异无统计学意义。CD8+T 细胞介导的细胞毒作用使结核分枝杆菌感染的靶细胞溶解死亡或凋亡，CD8+T 细胞消耗增多而数量减少。与国内外报道存在部分差异。杨玉婷等[14]研究发现肺结核患者与肺部非结核感染患者相比较，外周血CD4+T 细胞数减少，且发生肺结核的危险性随着CD4+T 细胞数的降低而显著升高。另有研究结果显示结核病患者的CD4+，CD8+T 细胞数及CD4+/CD8+比值均明显低于健康人群[15-16]。而LI 等[17]发现结核患者的CD4+，CD8+T 细胞数明显低于健康人群，但CD4+/CD8+比值无明显差异。耐多药结核患者CD4+，CD8+T 细胞数及CD4+/CD8+比值明显高于非耐药结核患者,CD4+/CD8+比值升高可能是活动性结核发生耐药的关键线索[16-17]。因此可推测结核病患者外周血T淋巴细胞亚群的表达受多种因素影响。T淋巴细胞亚群的水平可为临床评估患者细胞免疫功能提供参考。本研究纳入的结核病患者包含肺结核和肺外结核，未统计有无发生耐药以及有无并发其他感染，可能是造成研究结果存在差异的原因。

本研究发现，HIV/TB 组和HIV 组的CD3+，CD4+T 细胞数及CD4+/CD8+比值均明显低于TB组和健康对照组，HIV 组的CD8+T 细胞数明显高于TB 组。HIV 感染人体后，特异性杀伤CD4+T 细胞，使CD4+T 细胞数进行性减少，同时CD8+T 细胞异常激活、数量增加，CD4+/CD8+比值降低甚至倒置，导致细胞免疫功能缺陷。而TB 感染主要是T 细胞通过细胞免疫应答消耗增多，由此可见HIV感染或并发TB 感染对机体细胞免疫功能损伤的严重程度远大于单纯TB 感染。当HIV/TB并发感染时，HIV 病毒可诱导免疫衰老和持续免疫激活，导致CD4+和CD8+T 细胞数量减少和功能受损，严重增加了TB 内源性复燃和外源性再感染的风险[6-7]。CD4+T 细胞数越少，未进行抗逆转录病毒治疗（antiretroviral therapy,ART）的HIV 患者感染TB 的风险越高[11-12,18]。CD4+/CD8+比值越低，HIV/TB并发感染患者临床症状越严重[13,15]。与聂静敏等[19]研究结果一致。其还发现随着CD4+T 细胞数的下降，单纯HIV 感染者比HIV/TB并发感染患者的CD4+/CD8+比值下降更明显。本研究发现HIV/TB并发感染患者和单纯HIV/AIDS 患者的外周血T淋巴细胞亚群表达水平及HIV RNA载量差异均无统计学意义，表明HIV/TB并发感染时，机体细胞免疫功能损伤的机制并非HIV 和TB 感染简单的叠加，而是复杂的免疫调节过程[20]，仅从淋巴细胞亚群计数和HIV RNA载量上无法鉴别HIV/TB并发感染与单纯HIV 感染。本研究进一步分析了HIV/TB并发感染患者和单纯HIV/AIDS 患者外周血CD3+，CD4+，CD8+T细胞数及CD4+/CD8+比值与HIV RNA载量的相关性，结果发现CD3+，CD4+，CD8+T 细胞数和CD4+/CD8+比值与HIV RNA载量均呈显著负相关，提示无论HIV/AIDS 有无并发TB 感染，机体细胞免疫功能均随着病毒载量的升高而显著降低。因此，CD3+，CD4+，CD8+T 细胞数和CD4+/CD8+比值可用于观察患者抗病毒治疗效果和细胞免疫功能重建。本研究存在以下不足之处：纳入研究的样本量少；研究对象均为男性患者，可能存在选择偏倚；未统计TB 患者是否发生耐药。今后应扩大样本量，完善研究对象年龄、性别、有无耐药等影响因素，对HIV/TB并发感染患者抗病毒治疗后外周血T淋巴细胞亚群的变化进行研究。

综上所述，HIV/TB并发感染患者外周血CD3+，CD4+T 细胞数和CD4+/CD8+比值均明显降低，HIV感染者无论有无并发TB 感染，机体的细胞免疫功能均随着病毒载量的升高而显著降低。