卵巢癌组织中DR-NM23的表达及对细胞增殖和转移的影响

周 红，周江洪（中南大学湘雅医学院附属株洲医院妇科，湖南株洲 412000）

卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤，由于早期症状缺乏特异性，卵巢癌患者大多在疾病进展到晚期时才被诊断出，这时卵巢癌已经累及腹膜腔或转移至其他器官[1,2]，寻找有效的诊断和治疗卵巢癌的生物标志物具有重要意义。NM23基因是一种与肿瘤密切相关的基因，目前研究主要集中在NM23-H1中，有细胞实验和体外实验结果显示NM23-H1 具有抑制卵巢癌转移的作用[3]。DR-NM23 是NM23家族中的一员，又被称为NM23-H3 或NME3，是一种与肿瘤发生相关的蛋白[4]，临床研究发现DRNM23 的低表达与乳腺癌预后不良有关，提示DRNM23 的抑癌作用[5]。一项荟萃分析提示DR-NM23与卵巢癌的分化程度和淋巴转移有关，但是DRNM23 与卵巢癌病理特点的关系和调控机制尚不清楚[3]。

为探究DR-NM23 在卵巢癌组织中的表达水平及对细胞增殖和转移的影响，本研究通过对比卵巢癌癌旁组织、肿瘤组织DR-NM23 表达水平，并通过在卵巢癌细胞系中过表达、沉默DR-NM23，研究DR-NM23 在卵巢癌细胞中的生物学行为。

1 材料与方法

1.1 研究对象 随机选择2018年6月～2019年6月间中南大学湘雅医学院附属株洲医院收治的卵巢癌患者68 例，年龄35～74 岁，中位年龄51 岁，FIGO 分期I，II，III，IV 分别为10，23，24 和11 例。收集肿瘤组织和癌旁组织标本保存于液氮中。纳入标准：①年龄20～75 岁；②经过病理学活检或手术确诊为卵巢癌；③首次确诊。排除标准：①并发其他恶性肿瘤；②接受过放疗、化疗治疗。本次研究获得本院伦理委员会审批，所有患者和家属知情同意。

1.2 仪器与试剂 兔抗人DR-NM23（博奥森生物公司，中国），人卵巢癌细胞系SKOV3（ATCC 公司，美国），DMEM 培养基（Invitrogen 公司，美国），DR-NM23 过表达和DR-NM23 沉默质粒（Thermo Fisher 公司，美国），Lipofectamine 2000（Invitrogen公司），细胞计数试剂盒-8 试剂盒（Beyotime 生物技术研究所，中国），Transwell 小室（Becton Dickinson 公司，美国），逆转录和SYBR Green PCR Master Mix qPCR 试剂盒（Roche 公司，瑞士），Anti-DR-NM23 抗体（Abcam，美国），PVDF 膜（Bio-Rad 公司，美国），倒置显微镜（Olympus 公司，日本）。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化染色检测DR-NM23的表达:将样本组织脱水、透明后包埋至蜡块中，冷冻20 min，切成4μm 切片并在65℃下烘烤30 min。将切片经脱蜡、水化和抗原修复处理后加入10%（m/v）的H2O2溶液，洗涤后加入兔抗人DR-NM23 在37℃孵育60 min，PBS 缓冲液冲洗3 次，每次3 min。加入100μl 增强酶标山羊抗兔IgG 聚合物覆盖组织，室温孵育60 min。滴加DAB 显色5～6 min 复染后使用苏木紫染色20 min，然后脱水透明，封片后使用显微镜观察染色结果。通过半定量法分析染色强度和染色范围，二者相乘得到染色结果，总分为0～12，先根据染色范围即阳性细胞所占百分比打分：＜5%为0 分，5%～25%为1 分，25%～50%为2 分，50%～75%为3 分，＞75%为4 分；再根据染色强度打分：无色0 分，浅黄色1 分，棕黄色2 分，棕褐色3 分；9～12 分为强阳性（＋＋），5～8 分为弱阳性（＋），0～4 分为阴性（－），染色强度与染色范围的乘积为染色强度得分。

1.3.2 细胞分组和转染:培养的SKOV3 细胞稀释后按1×105个/孔的密度接种于12 孔板，将SKOV3 细胞分为NC 组、DR-NM23 组和siDRNM23 组，其中DR-NM23 和siDR-NM23 组利用Lipofectamine 2000 按照说明书分别转染DR-NM23和siDR-NM23 质粒，NC 组转染空载质粒作为阴性对照，转染24 h 后收集细胞通过检测DR-NM23 的mRNA 和蛋白表达水平评估转染结果。

1.3.3 qPCR:SKOV3 细胞转染成功后收集细胞RNA 样品，裂解后提取细胞总RNA，使用cDNA逆转录试剂盒将1μg RNA 合成cDNA。然后使用qPCR 试剂盒对合成的cDNA 进行qPCR实验。 以GAPDH 作为内参，通过2-ΔΔCt分析DR-NM23 的mRNA表达水平。DR-NM23：F:5’-AAGCAGCTGGAAGGAACCAT-3’,R:5’-GGTCGGGGATGGTAACACTG-3’；GAPDH：F:5’-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’，R:5’-CAAAGTTGTCATGGA-3’。

1.3.4 Western blot :SKOV3 细胞转染成功后收集细胞蛋白样品，组织样品经过充分研磨后通过RIPA收集总蛋白，取50μg 蛋白经SDS-PAGE 分离，转膜后用脱脂奶粉在室温下封闭3h，加入1∶500 稀释的anti-DR-NM23 在4℃孵育过夜，用TBST 清洗5 次，每次5 min，然后加入1∶5 000 稀释的二抗，TBST 清洗5 次，每次5 min，通过ECL 试剂盒进行蛋白曝光，GAPDH 为内参，使用ImagePD 对蛋白条带的灰度进行定量分析。

1.3.5 CCK-8:培养的SKOV3 细胞稀释后按3×105个/孔的密度接种于96 孔板，利用Lipofectamine 2000 按照说明书将质粒成功转染48 h 后，用PBS清洗细胞2次，每孔细胞中加入CCK-8孵育4h显色，通过酶标仪检测450 nm 处的吸光度（A）值。

1.3.6 细胞划痕实验检测细胞迁移:培养的SKOV3细胞消化后将1×106个/孔在6 孔板中培养，细胞贴壁后且90%左右细胞汇合为单层细胞时，利用200μl 移液枪头做垂直划痕，将划掉的细胞洗去。然后在相同条件下继续培养48 h。在倒置显微镜下观察细胞划痕边缘移动距离的百分比，重复实验3 次。

1.3.7 Transwell 检测细胞侵袭:在Transwell 小室的上室加入基质胶，干燥后将培养的SKOV3 细胞制成细胞悬液并取100μl 加入Transwell 上室，底室加入完全培养基，常规条件下培养48 h 使细胞侵入底室，取出小室用PBS 清洗细胞2 次，将侵入的细胞用4%（m/v）多聚甲醛固定，后用0.2%（m/v）结晶紫染色15 min，随机选取细胞视野利用显微镜观察并计数，分析细胞的侵袭情况。

1.4 统计学分析 SPSS 19.0 软件被应用于数据处理，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料采用%表示，组间比较采用χ2检验。多组间比较使用方差分析，事后检验采用LSD-t检验，不符合正态分布的则采用Mann-WhitneyU检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DR-NM23 在卵巢癌组织中的表达 见图1。在68 例癌旁组织中，DR-NM23 的平均染色强度为7.05± 2.05。卵巢癌组织中DR-NM23 的平均染色强度为2.68±0.75，低于癌旁组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图1 免疫组化染色检测DR-NM23 蛋白

2.2 DR-NM23 表达率与一般资料和病理特点的相关性 见表1。根据DR-NM23 表达率将患者分为DR-NM23 低表达组和DR-NM23 高表达组，结果显示卵巢癌组织中DR-NM23 表达率与是否绝经、肿瘤大小以及局部浸润无相关性（均P＞0.05），低分化、出现淋巴转移和远端转移的组织中DRNM23 表达水平相对较低，差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 DR-NM23 表达率与一般资料和病理特点间的相关性[n(%)]

2.3 建立过表达、沉默DR-NM23 细胞系 见表2和图2。为分析DR-NM23 对卵巢癌细胞生物学行为的影响，利用SKOV3 细胞通过质粒转染分别构建了DR-NM23 沉默和过表达的模型，以GAPDH表达水平为内对照，结果显示DR-NM23 组的mRNA 和蛋白表达水平高于NC 组，而siDR-NM23组低于NC 组，差异均有统计学意义（P＜0.05），提示DR-NM23 过表达、沉默细胞系建模成功。

表2 各组DR-NM23 mRNA，蛋白相对表达水平（±s）

表2 各组DR-NM23 mRNA，蛋白相对表达水平（±s）

组别DR-NM23 mRNADR-NM23 蛋白NC 组1.05±0.740.36±0.51 DR-NM23 组2.12±0.830.83±0.79 siDR-NM23 组0.34±0.260.24±0.61

图2 各组DR-NM23 蛋白表达水平（Western blot）

2.4 DR-NM23 对肿瘤细胞增殖能力的影响 通过CCK-8 检测各组细胞的增殖能力，结果显示与NC 组（0.68±0.11）比较，siDR-NM23 组的吸光度（1.16±0.18）相对较高，而DR-NM23 组的吸光度（0.47±0.07）相对较低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 DR-NM23 对肿瘤细胞迁移能力的影响 见图3。通过细胞划痕实验检测迁移，结果显示与NC组（62.34%±2.15%）比较，siDR-NM23 组划痕边缘移动距离的百分比（88.58%±5.48%）相对较高，而DR-NM23 组的划痕边缘移动距离的百分比（45.12%±3.76%）相对较低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

图3 DR-NM23 对肿瘤细胞迁移的影响

2.6 DR-NM23 对肿瘤细胞侵袭能力的影响 见图4。通过Transwell 实验检测DR-NM23 对迁移的影响，结果显示与NC 组（125.54±8.15 个）比较，siDR-NM23 组的侵袭细胞数目（207.26±13.52个）相对较高，而DR-NM23 组的侵袭细胞数目（59.57±5.02 个）相对较低，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

图4 DR-NM23 对肿瘤细胞侵袭能力的影响

3 讨论

激素水平、遗传学因素和环境因素是影响卵巢癌患者预后的关键因素，寻找有效的卵巢癌的生物标志物和探究卵巢癌转移的机制具有重要意义[6-7]。DR-NM23 在合成三磷酸核苷中起主要作用，可促进ATPγ 磷酸酯转移到NDPβ 磷酸酯上，可以通过抑制粒细胞分化和诱导凋亡，在正常的造血中起作用，在白血病细胞中，DR-NM23 可以促进分化，而DR-NM23 的降低会与白血病有关[8-9]。另有研究表明DR-NM23 在乳腺癌中具有抑癌作用。

为探究DR-NM23 在卵巢癌组织中的表达水平及对肿瘤细胞增殖和转移的影响，本研究通过对比卵巢癌癌旁组织、肿瘤组织DR-NM23 表达水平，并通过在卵巢癌细胞系中过表达、沉默DRNM23，研究DR-NM23 在卵巢癌肿瘤细胞的作用机制。结果表明，DR-NM23 在卵巢癌组织中表达水平低于癌旁组织，进一步的分析结果表明低分化、出现淋巴转移和远端转移的组织中DR-NM23 表达率相对较低。过往的结果显示DR-NM23 在胰腺癌组织中低表达，可能起到抑制胰腺癌的作用[10]。马俊等[11]的研究结果也显示前列腺癌患者尿液中的DR-NM23 mRNA水平显著降低，并与前列腺癌细胞低分化有关。这提示DR-NM23 可能起到抑癌作用，卵巢癌细胞的分化和转移与DR-NM23水平降低有关。

本研究利用SKOV3 细胞通过质粒转染分别构建DR-NM23 沉默和过表达细胞系，结果显示DRNM23 蛋白水平下调后，细胞增殖、迁移和侵袭能力显著升高，而过表达DR-NM23 蛋白水平得到相反的结果，提示DR-NM23 可抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力。研究指出，DR-NM23 的下调与结直肠癌的侵袭和转移密切相关，DR-NM23的表达状态可能是结直肠癌患者的潜在预后因素[12]。CHEN 等[4]认为DR-NM23 与葡萄糖代谢有关，而葡萄糖代谢异常也是肿瘤细胞的特点之一，提示DR-NM23 在肿瘤发生中的关键作用。也有研究显示DR-NM23 具有促进TLR5/NF-κB 通路的作用，从而促进先天免疫参与介导的促炎并抑制肿瘤的生长[13]。结合本研究结果，提示DR-NM23 可能具有抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用。

综上所述，DR-NM23 在卵巢癌组织中低表达，可能具有抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的作用。