干细胞转录因子Oct4及Sox2对宫颈癌细胞成瘤、迁移和浸润能力的影响

曼热帕·吐尔逊，马 蓉，祖菲娅·艾力（新疆医科大学第一附属医院妇科中心，乌鲁木齐 830000）

宫颈癌（cervical cancer）是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤，据统计宫颈癌患者治疗后3年内出现转移和（或）复发的发生率高达30%～40%，虽然放、化疗技术和方案近年来已不断优化，但晚期宫颈癌患者治愈率未见显著提高，预后极差[1-3]。因此，探讨宫颈癌细胞侵袭转移的作用机制对改善宫颈癌患者预后尤为重要。研究发现宫颈癌侵袭转移的重要原因为肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)，作为肿瘤体内的肿瘤细胞亚群，它具有自我更新和分化能力，能够重建肿瘤团并转移到其他位点，是肿瘤不断增殖、侵袭、浸润、转移甚至复发的原因[4]。而CSCs 中重要转录因子Oct4 和Sox2 可调控CSCs 和体细胞细胞重编程，其中Oct4属于POU(Pit-Oct-Unc)转录因子家族，是CSCs 关键的表面标记物，研究表明，Oct4 介导的致瘤性与上皮-间充质转化的调控有关[5-6]。Sox2 是SOX 区域Y 相关HMG（High Mobility Group，HMG）蛋白家族的成员，通过与Oct4 等干细胞标记物形成复合物，在癌症中维持干细胞样特性。研究表明[7-9]，Oct4 和Sox2 在肿瘤发生和预后中起关键作用，且宫颈癌细胞中Oct4 表达明显高于癌旁细胞。但Oct4，Sox2 对宫颈癌细胞的预后意义尚不明确。故本研究拟将外源性Oct4 和Sox2 转染至HeLa 细胞中，检测其对HeLa 细胞成瘤、迁移、浸润能力的影响，以期为宫颈癌早期诊断及靶向治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株来源 HeLa 细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司（货号：CL-0349；规格：1×106cells/T25 培养瓶）。收到后液氮冻存等待复苏。HeLa 细胞培养：细胞在DMEM 培养液中培养，含15ml/dl 新生牛血清、双抗；5ml/dlCO2，37℃培养箱中培养。

1.2 仪器与试剂 实验所用主要仪器为：气套式触屏CO2恒温培养箱（美国精骐，CI-191X），生物安全柜（苏净安泰，BSC-1304 ⅡA2），倒置生物显微镜及荧光显微镜（宁波舜宇，ICX41，CX40-RFL），凝胶成像分析系统（北京六一，WD-9413B），荧光定量PCR 仪（杭州朗基，Q2000B）；所用主要试剂为：Lipofectamine® 2000 Reagent（Invitrogen，2125361），DMEM 基础培养基（GIBCO，8120358），SYBRGreenPCR 试剂盒（北京全式金，AQ601-01），逆转录试剂盒（北京全式金，at311-02）。

1.3 方法 构建Oct4 过表达质粒、Sox2 过表达质粒及空载质粒。取出冻存的HeLa 细胞进行复苏后放入5ml/dl CO2培养箱中进行培养；显微镜下观察贴壁细胞HeLa 密度，当生长至细胞培养皿面积的90%左右即可传代，传至4 代时进行细胞转染。在转染24 h 后，可拍照观察并用于后续试验。

1.3.1 实验分组：HeLa 细胞进行复苏、传代及培养，达到所需细胞量，按转染质粒的不同分为4 组，铺至6 孔板中，每组1 个孔（细胞量为1×106）：正常对照组（HeLa 细胞进行正常复苏、传代，不进行任何处理）、Oct4 过表达组（转染Oct4 过表达质粒的HeLa 细胞）、Sox2 过表达组（转染Sox2过表达质粒的HeLa 细胞）、过表达空载组（转染过表达空载质粒的HeLa 细胞）。

1.3.2 荧光定量PCR 检测验证转染效率:设计引物并合成，引物序列见表3。采取溶液法分别提取各组细胞中的总RNA，检测其浓度并用凝胶电泳验证RNA 完整性；按照试剂盒法配置逆转录反应体系及荧光定量反应体系，将提取的RNA 逆转录为cDNA，并进行荧光定量。

表1 引物序列

1.3.3 细胞功能检测

1.3.3.1 细胞划痕实验：用于检测细胞的迁移能力，具体方法：提前在6 孔板细胞背后均匀划3 ～5 条橫线后加入约5×105个细胞，垂至于背后的横线垂直划痕，用PBS 洗细胞3 次，去除划下的细胞，加入无血清培养液后放入37℃ 5ml/dl CO2培养箱按0，6，12，24h 拍照。完成实验后，根据24h 内不同的4 个时间点，用软件统计细胞迁移的面积，用以下公式计算不同组不同时间点的迁移率：

1.3.3.2 Transwell 侵袭实验：用于检测细胞的侵袭能力，具体方法：用BD 公司的Matrigel 包被Transwell 小室底部聚合成凝胶；消化细胞，调整细胞密度至5×105/ml，加入Transwell 小室，24 孔板下室一般加入完全培养液；放入37℃ 5ml/dl CO2培养箱培养24h；取出 Transwell 小室PBS 洗后用多聚甲醛固定60 min，将小室适当风干后台盼蓝避光染色。400 倍显微镜下随机4 个视野观察细胞，采取随机的方式选取3 个视野计数穿过小室基底膜的细胞数。

1.3.3.3 成球实验：用于检测细胞的成球能力，具体方法：将生长状态良好的细胞消化后离心，用PBS 清洗2 次，干细胞培养液(DMEM+1×B27+20ng/ml bFGF+20ng/ml EGF)重悬细胞，计数；选择超低吸附细胞培养六孔板，每孔加入细胞100 个，加2ml 培养液培养7 天，观察成球状态。完成实验后，显微镜观察判定细胞成球个数。

1.4 统计学分析 采用Excel 进行数据录入，采用prism 7.0 进行统计学分析及制图，多组比较采取方差分析，进一步两组比较采取LSD-t检验，检验水准a=0.05，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR 荧光定量验证 见表2。本研究F 检验及两两比较t检验结果显示，Oct4 及Sox2 表达水平在Oct4/Sox2 过表达组显著高于正常对照组和空载组，差异均有统计学意义（t=51.51，18.94；51.48，18.94，均P＜0.000 1），表明转染成功。

表2 各组细胞转染后表达情况（n=3）

2.2 细胞功能检测 本研究F 检验及两两比较t检验结果见表3。Otc4，Sox2 过表达组细胞侵袭数量、迁移率及成球数量均低于过表达空载组，差异有统计学意义（t=4.706，4.814；5.105，5.105；5.49，5.795，P=0.0419，0.0377；0.0283，0.0283；0.0195，0.0146）；Otc4，Sox2 过表达组细胞迁移率及成球数量还低于正常对照组，差异有统计学意义（t=4.668，4.668；4.575，4.88，P=0.0436，0.0436；0.0478，0.0353）。

表3 各组细胞功能检测（n=3）

3 讨论

虽然癌症干细胞理论已经被证明适用于不同的癌症，但CSCs 在宫颈癌发生发展中的作用还需要更多的研究。既往研究发现，肿瘤邻近正常组织和肿瘤前组织中CSC 标记物的表达增加，提示正常肿瘤邻近细胞的早期分子变化，可能是CSCs 调控处于正常细胞逐步转化为癌细胞[4,10]。放疗耐药是宫颈癌根治性放疗患者治疗失败和死亡的主要原因。目前研究表明CSC 比亲代细胞更可能具有抗辐射能力，因此可以通过CSC来解释肿瘤辐射抗性。目前已经证实的CSCs 标志物包括 CD44，Oct3/4，Sox-2，C-Mye 及Nanog 等。 其中，Oct4 和Sox2的异常表达可能参与多种癌症的癌变[11]。现有研究表明[6,8]，宫颈癌组织分化程度与Oct4，Sox-2的表达呈负相关，即宫颈癌组织分化程度越高，Oct4，Sox-2的表达水平越低。但是关于Oct4，Sox-2 转录基因在分子水平上调控宫颈癌细胞的相关研究较为少见，故本次研究采用CSCs 主要的两个表面标志物对宫颈癌分子水平调控初探，检测Oct4，Sox2与宫颈癌细胞发生存在的关系，以期找寻宫颈癌的早期诊断和治疗、减少肿瘤转移和复发、延长患者的生存期的些许线索。

为进一步探讨两者对宫颈癌细胞迁移能力、侵袭能力以及成瘤分子机制的影响，本研究通过建立Oct4，Sox2 过表达的稳定转染细胞系（HeLa 细胞系），Otc4，Sox2 过表达组细胞侵袭数量、迁移率及成球数量均低于过表达空载组，发现外源性Oct4，Sox-2 表达显著降低了HeLa 细胞的迁移能力、侵袭能力以及成瘤特性等生物学特性。这为目前关于Oct4，Sox-2基因在宫颈癌组织学方面研究结果提供了细胞及分子水平的初步探索思路。在乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌组织中分别存在Oct4，Sox2基因表达上调的现象，刺激肿瘤细胞的成瘤特性[5,12-15]。与此相反，LIU 等[16]学者发现Sox2 的高表达与子宫颈癌细胞系（SiHa 细胞）的细胞分化缺乏有关，并有助于细胞迁移和侵袭。考虑形成两种相反结论的原因是由于Oct4 和Sox2 在胚胎干细胞中通过Oct4/ Sox2 复合物协同工作并自我调节，但是在体内恶性病变中Oct4 和Sox2 之间的相关性尚未得到明确的解释。Sox2 的过表达抑制了Oct4 启动子在胚胎癌细胞中的活性[17]。Oct4 和Sox2 通过Oct4/Sox2 复合物协同作用，但有报道称Oct4，Sox2 和Nanog 与核磷素形成单独的复合物来控制干细胞命运决定[18]。目前已有研究表明，检测癌症组织样本Oct4 和Sox2 与患者生存率的相关性尚未定论[6,19]，在宫颈癌少见相关性的报道研究。此外，HU 等[20]人也报道了Oct4 和Sox2 在肺癌组织样本中没有共表达，也显示了不同的生存结果。

本研究结果提示可将Oct4 和Sox2 作为宫颈癌的生物标志物，然而肿瘤细胞的侵袭转移过程是多通道、多分子共同调控，需要进一步探究Oct4，Sox2 两者分别和（或）协同对宫颈癌细胞生物行为学的调控机制，明确主要的调控通路和关键靶点，以期为宫颈癌的早期诊断和靶向治疗提供新思路。