X射线照射对人外周血淋巴细胞miRNA表达谱影响的初步研究

宋秀军，卢敬泰，牛冬梅，赵广利，吕 进，王 硕，李 娜，张阳东（.火箭军特色医学中心，北京 00088；.火箭军96606 部队医院，河南洛阳 47003）

电离辐射对人体会造成严重伤害，长期影响健康，甚至导致肿瘤[1-2]。在职业暴露及辐射事故中，对辐射损伤做出及时有效的评估是当前研究的热点之一。因此，寻找合适的生物标志物对早期快速筛查接触人群具有重要意义。目前国内外学者通过研究已将多种miRNAs 用于肿瘤诊断、治疗和预后判断的生物标志物[3-4]。本研究通过低密度流体芯片技术，分析筛选经X射线诱导的外周血淋巴细胞差异表达的miRNAs，为寻找新的辐射相关的生物标志物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 采集7 例健康成年男性外周血液标本。受试者平均年龄 32 周岁。所有受试者均征得书面知情同意，研究方案经火箭军特色医学中心伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂 直线加速器（由火箭军特色医学中心放疗科提供，瑞典Elekta 公司Precise 型）；实时荧光定量PCR 仪（ABI7900，ABI 公司）；PRMI 1640 培养液和胎牛血清均购自美国Gibco公司；microRNA 提取试剂盒（mirVana™ miRNA Isolation Kit）、microRNA 逆转录试剂盒（TaqMan®MicroRNA Reverse Transcription Kit）、miRNA 引物和探针、microRNA 定量检测试剂（TaqMan®Universal PCR Master Mix）、miRNA 低密度流体芯片（Taqman Low Density Array，TLDA）均购自美国ABI 公司。

1.3 方法

1.3.1 样本的采集与分组：所有受试者均采集外周血各20 ml，分别用2Gy 与4 Gy X射线（吸收剂量率为1.0Gy／min）体外照射，于12h 和24h 分离淋巴细胞。以未照射的人外周血淋巴细胞为对照组。

1.3.2 miRNA 的提取：用microRNA 提取试剂盒提取各组细胞总RNA。具体步骤如下：加入600μl裂解液3min，充分裂解细胞；加入1.25 倍体积的无水乙醇，充分混匀；将混合液吸入至过滤柱内，10 000 r/min 离心15s，弃去管内液体；加入700μl miRNA Wash Solution 1，离心10s，弃去管内液体；加入500μl miRNA Wash Solution 2/3，按以上步骤离心，弃去管内液体，重复此步骤；将离心柱重新放入收集管内，离心1min；加入50μl Nucleasefree Water，离心30s，洗脱RNA。

1.3.3 miRNA 芯片检测：采用Taqman 低密度流体芯片检测不同剂量照射后人外周血淋巴细胞miRNA表达谱变化。TaqManArray MicroRNA 芯片分为A，B 板，可同时检测760 种成熟miRNAs的表达。加入特异性茎环引物反转录获得的cDNA 后，采用ABI PRISM 7900 测序仪进行差异表达miRNA的筛选。反应条件为：50℃ 2min；95℃ 10min；95℃15s，60℃ 1min，共45 个循环，获得每种miRNA 特异性扩增曲线。

1.3.4 结果判读 miRNA 相对表达量计算方法：以对照组中U6 miRNA的表达量为内参，△△Ct法[5-6]计算各组miRNA 相对对照组表达量的倍数。公式为：Fold change=-△△Ct=-（△Ct实验组-△Ct对照组）；△Ct=Ct待测样品-Ct内参。结果判读：表达结果以≥2 和＜-2 为结果表达异常。

1.4 统计学分析 使用 SPSS 19.0 软件进行数据统计分析，数据以均数±标准差（±s）表示，组间采用独立样本t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 X射线照射人外周血淋巴细胞差异表达的miRNAs 经2 Gy 与4 Gy X射线照射人外周血淋巴细胞12h 或24h 后，对760 种miRNAs 进行差异表达的筛选。结果显示，经2Gy X射线照射12h 后表达升高的miRNAs 有178 种，表达降低的miRNAs 有32 种；2Gy X射线照射24h 后表达升高的miRNAs 有343 种，表达降低的miRNAs 有28 种。经4Gy X射线照射12h 后表达升高的miRNAs 有105 种，表达降低的miRNAs 有441 种； 经4Gy X射线照射24h 后表达升高的miRNAs 有121 种，表达降低的miRNAs 有303 种。

2.2 X射线照射人外周血淋巴细胞miRNA 的时间反应性 为筛选出具有时间效应性的miRNAs，对差异表达的miRNAs 进一步分析。结果发现，2 Gy X射线照射人外周血淋巴细胞12h 和24h 可以诱导48 种随时间的延长而表达上调的miRNAs，53 种随时间的延长而表达下调的miRNAs，见图1a，1b；4Gy X射线照射人外周血淋巴细胞12h 和24h 可诱导32 种随时间的延长而表达上调的miRNAs，14 种随时间的延长而表达下调的miRNAs，见图1a，1b。其中20 种miRNAs 同时表现出时间反应性，即随着照射时间的延长而升高，其升高倍数为0.25～27.43 倍,见图1a，2。8 种miRNA 随着照射时间的延长而降低，其下调倍数为0.11～13.84 倍，见图1b。

图1 X射线照射人外周血淋巴细胞具有时间反应性差异表达的miRNAs

2.3 X射线照射人外周血淋巴细胞miRNA 的剂量反应性 为筛选出具有剂量效应性的miRNAs，对差异表达的miRNAs 进一步分析。结果发现，经2Gy 和4Gy X射线照射人外周血淋巴细胞12h 后，可以诱导12 种随剂量的增加而表达上调的miRNAs，45 种随剂量的增加而表达下调的miRNAs，见图3a，3b；经2Gy 和4Gy X射线照射人外周血淋巴细胞24h 后，可诱导19 种随剂量的增加而表达上调的miRNAs，56 种随剂量的增加而表达下调的miRNAs（见图3a，3b）。2Gy 与4Gy X射线照射人外周血淋巴细胞12h 或24h 可以诱导34 种miRNAs 随剂量的增加而表达上调及77 种miRNAs 随剂量的增加而表达下调，且表现出特定时间点的剂量反应性；其中仅有2 种miRNAs 同时表现出对2Gy 与4Gy 的剂量反应性，即随着照射剂量的升高而升高，其升高倍数为0.16～1.12 倍，见图3a，4。24 种miRNAs 同时表现出对2Gy 与4Gy 的剂量反应性，随着剂量的增加而降低，其下调倍数为0.08～45.34，见图3b。

图2 X射线照射人外周血淋巴细胞具有时间反应性且表达上调的miRNAs

图3 X射线照射人外周血淋巴细胞具有剂量反应性差异表达的miRNAs

图4 X射线照射人外周血淋巴细胞具有剂量反应性且表达上调的miRNAs

2.4 四种差异表达的miRNAs PCR 单管验证 选取一种在芯片结果中具有时间反应性且表达上调的miRNA 即has-miRNA-21，三种在芯片结果中不同时间点和剂量点表达升高或降低的miRNAs 即 hasmiRNA-424，has-miRNA-505 和has-miRNA-423-5p进行PCR 方法的单管验证，其与芯片结果不完全一致，总体表现为表达水平低于芯片检测水平，见图5。

图5 四种差异表达的miRANs PCR 单管验证

3 讨论

核辐射事故的发生往往具有不可预测性，会给公众造成严重后果。寻找准确、简便、快速的辐射应急反应生物标志物具有重要意义。目前有以染色体畸变为代表的细胞遗传学技术是辐射生物剂量的金标准[7-8]。此外，美国哥伦比亚大学研发了自动化分析淋巴细胞微核和淋巴细胞γ-H2AX的技术平台[9]，REPIN 等[10]利用此技术平台实现微量血淋巴细胞微核分析并建立了剂量上限为5Gy的剂量效应曲线。但是这些评估方法有其局限性，非常费时而且难以广泛应用，因此寻找能够早期快速评估辐射损伤程度的微创生物标志物更具有明显的优势。

miRNAs 广泛存在于真核生物中，在细胞增殖、分化、凋亡及基因调控中起重要作用[11]。近年来，miRNAs 作为微创生物标志物已显示良好的应用前景，被应用于筛查肿瘤等复杂疾病[12-14]。因有其独特的优势，如采集方便、在室温下或经过反复冻融循环后的相对稳定性、可高通量快速检测、高特异度和敏感度等特点，所以是一种理想的生物标志物[15-16]。动物实验研究中发现，miRNA 在血浆中的差异表达与辐射损伤有关[17]。电离辐射可以影响特定miRNA的表达水平，并具有辐射剂量和时间依赖性[18]。

目前，国内外关于人外周血淋巴细胞中miRNAs作为辐射生物剂量剂的研究相对较少。因此，本研究应用低密度流体芯片技术，对不同剂量X射线照射后人外周血淋巴细胞中760 种miRNAs的表达水平进行初步分析。结果发现，在2 Gy 与4 Gy X射线照射后，20 种miRNAs 随着照射时间的延长而升高，8 种miRNA 随着照射时间的延长而降低，其中部分miRNAs 照射后表达升高，与SONG 等[19]的研究结果较为一致，说明X射线照射后淋巴细胞中miRNAs的表达是个动态的过程；2 种miRNAs随照射剂量增加而表达上调，24 种miRNAs 随剂量增加而表达下调，说明随着X射线照射后时间的延长，miRNAs的表达与剂量相关。上述研究结果中发现，有4 种miRNAs 即has-miR-629，hasmiR-138，has-miR-210 和has-miR-331-5p 同时表现出剂量和时间反应性，即随着照射剂量的增加及照射后时间的延长而表达下调，这与侯殿俊等[20]报道的人外周血miRNA-150 的变化规律相一致，提示这四种miRNA 作为辐射生物剂量标志物可能更具有可行性。从芯片结果和PCR 单管验证结果相比较发现，4 种miRANs 在时间和剂量的表达趋势上并不完全一致，这是否和本研究中样本数较少有关，还有待进一步的证实。

综上可知，本研究通过对外周血淋巴细胞miRNA表达谱分析发现，X射线既能够诱导部分miRNAs的表达，也能够抑制部分miRNAs的表达，这些差异表达的miRNAs 表现出一定的时间和剂量反应性，为进一步寻找评估辐射损伤的生物标志物奠定了实验基础。在后续的实验研究中，我们将探索对表现出时间和剂量反应性的miRNAs，增加时间点和射线照射的剂量范围，制作时间剂量效应曲线，进一步验证其作为辐射损伤标志物的可行性。