假单胞菌复合菌剂对高浓度废水中氨氮总氮浓度降解的研究

吴 婧，钟翔锦

(上田环境修复有限公司，江苏 常州 213000)

工业快速发展，导致含氮化合物排放量日益增长。2017年，全国排入河道氨氮、总氮污染物分别为96.34万吨和304.14万吨，严重影响整体环境质量。其中，各化工污染地块中污染废水或渗坑基坑水中存在大量氨氮、硝态氮及亚硝态氮污染[1-2]。如何去除超标氨氮、总氮污染物，成为污染水体治理关键。常见治理方法包括吹脱法、膜技术等，广泛应用于工业废水治理[3]。这些物化方法成本高，治理效果易反复，容易出现二次污染。生物处理技术，尤其微生物处理技术，具有工艺操作简单、反应过程稳定性高、成本低、不易产生二次污染物等优点，在污染水体治理中应用越来越广泛[4-5]。

微生物处理技术要点在于筛选出合适的菌剂，能耐受高浓度污染并持久高效地去除废水中氨氮、总氮污染物[6]。常见方法筛选出的多为单菌株，需要在后期实际工程应用中重新构建复合菌群，并考虑各菌种之间的拮抗作用进行配比[7]。本文从垃圾填埋场渗坑底泥中直接筛选驯化复合菌剂，通过实验确定营养物质和菌液比例，并在高浓度废水中进行应用实验。

1 材料与方法

1.1 培养基

硝化富集培养基(NSM)(g/L)： (NH4)2SO40.945～4.725，柠檬酸钠6.536，MgSO4·7H2O 1，NaCl 0.12，MnSO4·H2O 0.01，FeSO4·7H2O 0.05，KH2PO40.25，Na2HPO40.3。pH 7.0～7.5。固体培养基添加15～20 g/L琼脂。

异养硝化培养基(NM)(g/L)： (NH4)2SO44.725，柠檬酸钠12.25，MgSO4·7H2O 1，KH2PO40.25，Na2HPO40.3。pH 7.0～7.5。

1.2 富集培养与菌株筛选

活性污泥取自苏州某垃圾填埋场渗滤液坑塘底部。取泥水混合物 5 mL，悬浮于 45 mL NSM，30 ℃、150 r/min 恒温振荡培养 6 h。取初始氨氮质量浓度 200 mg/L 的NSM 100 mL，接入1%泥水混合物，30 ℃、150 r/min 富集培养 16 h;待培养液浑浊后取1%菌液接入NSM中，重复培养19次;待微生物适应后，将NSM氨氮质量浓度依次提升为 400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L、1000 mg/L，每个氨氮浓度培养液中分别驯化微生物20代。

1.3 菌株鉴定

将驯化后的微生物复合菌剂，以及进行多次纯化后挑选的单克隆，送样至上海美吉生物医药科技有限公司进行16SrDNA菌株鉴定。上游引物为27f(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)，下游引物为1492r(5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)。基因测序后通过同源性序列分析构建系统发育树。

1.4 生物脱氮性能研究

选择1代、40代、90代复合菌株为目标菌株，以0.2%接入氨氮初始质量浓度为约 1000 mg/L 的NM和某化工污染地块现场废水中，35 ℃、150 r/min 恒温振荡培养 25 d，定时取样检测培养液中总氮和氨氮含量，计算氨氮或总氮去除率。

1.5 检测方法

氨氮采用纳氏试剂分光光度法(HJ 535-2009)，总氮采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法(HJ 636-2012)。

2 结果与分析

2.1 复合菌剂的筛选鉴定

通过DNA提取、PCR扩增、样品纯化、基因检测等，将检测结果与NCBI数据库比对。结果显示，氨氮降解菌单克隆菌落与以下4种微生物序列结果100%匹配：蒙特利假单胞菌(Pseudomonas monteilii strain)、假单胞菌(Pseudomonas strain)、巴氏假单胞菌(Pseudomonas baetica strain)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida strain)。同时，通过分类学分析确定复合菌剂中微生物的种属和相对丰度，结果显示1代复合菌中有68.14%为假单胞菌属，18.29%为未分类的肠杆菌，6.52%为肠杆菌属；40代复合菌中99.99%都是假单胞菌属。综合分析复合菌主要成分为各种假单胞菌属菌株。如图1所示。

图1 氨氮降解菌单菌落的比对结果与进化树

2.2 复合菌剂对NM的氨氮总氮降解效果

如图2所示，未接入微生物的对照组NM中氨氮质量浓度有小幅度下降，20 d 后趋于稳定，最终氨氮质量浓度为 1033.67 mg/L，去除率维持在13%左右；接入1代、40代和90代复合菌液的NM中，氨氮质量浓度均有显著降低，25 d后趋于稳定，氨氮质量浓度最低为 89.87 mg/L，去除率最高达90.3%。反应 16 d 前，1代微生物对NM中氨氮去除率高于驯化筛选后期的40代和90代微生物；反应 25 d 后，1代微生物对NM中氨氮去除率低于40代和90代微生物。而总氮浓度的变化情况与氨氮有一定区别。随着反应时间增加，NM中总氮浓度有一定升高。接入1代复合菌液反应 25 d 后，总氮质量浓度没有显著降低趋势，反而有一定增加，平均总氮质量浓度从 645.59 mg/L 升高至 677.10 mg/L；接入40代或90代微生物菌液后，NM中总氮质量浓度有显著降低，平均总氮质量浓度从 659.38 mg/L 降至 282.88 mg/L，总氮去除率最高达59.5%。综上，复合菌液对NM中氨氮和总氮都具有一定去除效果，对氨氮去除效果更佳，且经过多次驯化筛选后的复合菌液降解效果更显著。

图2 高浓度NM中不同驯化代数复合菌对氨氮和总氮的降解效果

2.3 复合菌剂对修复场地废水中氨氮总氮的降解效果

如图3所示，未接入微生物的对照组废水中氨氮浓度有小幅度波动，25 d 后趋于稳定，平均质量浓度为 830.42 mg/L，平均去除率为4.7%；接入各代复合菌液后，废水的氨氮浓度均有显著降低，15 d 后趋于稳定，氨氮质量浓度最低为 38.28 mg/L ，去除率最高达95.4%。其中，反应 8 d 前，1代微生物对废水中氨氮去除率高于40代和90代微生物；反应 25 d 后，1代和40代微生物的氨氮去除率低于90代微生物作用。总氮浓度的变化情况与图2有一定区别。随着反应时间增加，废水中总氮浓度变化起伏较大，有一定程度升高，平均质量浓度为 930.03 mg/L。接入1代或40代复合菌液反应 25 d 后，总氮浓度初始具有降低趋势，平均质量浓度为 654.92 mg/L，但 15 d 后有一定升高，可能与部分氨氮转化为总氮污染物有关。接入90代菌液后，总氮浓度显著降低，平均质量浓度降至 330.68 mg/L，总氮去除率最高达66.2%。该复合菌液对修复场地高浓度废水中的氨氮总氮都具有一定降解效果，对氨氮降解效果更佳，且经过多次驯化筛选后的复合菌液对总氮降解效果更显著。

图3 高浓度污染废水中不同驯化代数复合菌对氨氮和总氮的降解效果

3 结论

通过对填埋场渗坑底泥中土著微生物菌种的筛选驯化，获得一种能高效持久降解氨氮和总氮的复合菌剂，经鉴定由不同的假单胞菌菌种构成，对高浓度氨氮或总氮污染废水具有长期高效降解的作用。该微生物复合菌剂扩培所需的营养物质配置简便，对高浓度污染水体中的氨氮和总氮具有高效持久的降解作用，无二次污染，操作简便，有利于大规模推广应用于污染水体的治理。