电麻醉对珍珠龙胆石斑鱼麻醉效应与血液生化指标的影响

白 贞，沈 建，徐文其，赵昕源，郭赛飞，马田田

(1 广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江，524088；2 中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所，上海 200092)

石斑鱼(Epinephelussp)滋味鲜美，肉质嫩滑，逐渐成为中国东海南部和南海地区的重要经济养殖品种[1]。2020年，中国石斑鱼捕捞与养殖总产量已经达到28.3万t，已成为深受国内消费者喜爱的高端海鲜品种[2]。其中，广东省与海南省为石斑鱼的主产区，产量占全国总产量的78.2%[2]。石斑鱼产量地域性特征明显，为满足内陆消费者对其的消费需求，石斑鱼的高效长途运输十分重要。石斑鱼对胁迫的应激反应十分剧烈，如果操作不当，极易造成品质恶化和死亡，严重影响了石斑鱼的养殖生产与运输流通[3-4]。

目前，鱼类麻醉主要有化学麻醉和物理麻醉两种[5]。物理麻醉方法主要分为生态冰温麻醉与电麻醉两种，物理麻醉方法没有禁药期，也没有药物残留风险[5-6]。电麻醉无须长时间的低温驯化，麻醉用时短，已经成功地运用在受精取卵、疫苗注射、标志流放等鱼类外科操作上[7]。但目前国内外针对电麻醉的研究，主要局限在淡水鱼，对海水养殖鱼类涉及较少；并且由于不同品种、规格的鱼对电击的承受能力有较大差异，电麻醉参数、效果各有不同；总体而言，电麻醉技术还处于探索阶段。

1 材料与方法

1.1 试验原料

本试验选用人工养成后上市的鲜活珍珠龙胆石斑鱼，采购于上海江杨水产市场，体质量500 ± 50 g。

采用充气有水运输至实验室，停食暂养24 h后进行试验。暂养条件参考朱乾峰[3]研究结果，设置为：循环过滤人工海水，曝气24 h，盐度22～25，水温26 ±1℃，溶氧6～8 mg/L。

1.2 仪器与设备

LR-24便携式鱼类电麻醉设备，美国SMITH-ROOT公司(输出电压50～990V ，输出频率1～120 Hz ，输出功率25～400 W ，通电区域1 000 mm×400 mm可调节)；SpectraMax i3多功能酶标仪，美国美谷分子仪器公司；VS-15000CFNⅡ高速冷冻离心机(转速0～15 000 r/min) ，上海民仪电子有限公司；LRH-70生化培养箱，上海齐欣科学仪器有限公司。

谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、乳酸脱氢酶(LDH)、葡萄糖(GLU)、乳酸(LD)试剂盒，鱼皮质醇酶联免疫检测试剂盒均来自南京建成生物科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 行为学试验

参考Chatakondi[8]的研究结果，采用标准脉冲直流电作为电源，占空比25%，频率30 Hz。 根据石斑鱼体质量进行预试验筛选，设定试验电压范围为80～150 V，电击时间3 s，每间隔10 V设置一个试验梯度。试验时，每次迅速将一尾鱼捞起投入电麻醉水箱(500 mm ×400 mm)，电击3 s后捞出投入暂养水箱，观察并记录试验鱼行为状态、休眠时间。每12尾鱼为一个试验组，每尾鱼仅实验1次。试验后统计不同试验组石斑鱼的麻醉率以及72 h存活率。

1.3.2 血液生化指标测定

根据行为学试验结果，优选100 V、110 V、120 V 3个电压梯度，将试验鱼电击后的即刻标记为0 h,分别在电击后的0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h抽取血液，测定指标。另取一对照组，不经任何电击处理，标记为0 V。

每次抽血时随机挑选3条试验鱼，迅速从恒温养殖箱中捞起，采用一次性注射器尾静脉或尾动脉取血，取血量约为2 mL，每尾鱼仅抽取一次血液。取血后将血液室温静置40 min、 4℃条件下，4 000 r/min反复离心，吸取上层血清测定其谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖、乳酸以及皮质醇含量。

1.4 指标测定

1.4.1 完全麻醉状态

参照冯广朋等[9]对西伯利亚幼鲟鱼电麻醉的不同阶段分类，当试验鱼身体僵直，鳃动微弱，对外界刺激无条件反射能力时，认为其进入完全麻醉状态。

1.4.2 休眠时间

电麻醉达到完全麻醉状态的试验鱼，认为其从停止受到电击刺激至可以自主直立游动，且对外界刺激有条件反射能力的时间为休眠时间。

1.4.3 麻醉率

将试验鱼在不同电压下电击3 s后，取达到完全麻醉状态的试验鱼统计麻醉率，计算公式为：

(1)

式中：A表示麻醉率%；n表示进入完全麻醉状态的试验鱼；N表示每组试验中试验鱼总数。

1.4.4 电麻醉阶段分类

参考Henyey等[10]对鲟鱼电麻醉效应的描述，将珍珠龙胆石斑鱼在电麻醉通电过程中的行为表现分为3个阶段：电刺激期、电紧张期以及电麻醉期。电刺激期试验鱼表现出快速游动、逃窜、挣扎等剧烈应激行为；电紧张期试验鱼多数停止游动，肌肉震颤，身体僵直，背鳍直立，侧鳍张开；电麻醉期试验鱼鱼体完全僵直，鳃盖大张，侧翻或者翻肚。

1.5 数据处理

数据采用SPSS 19.0和Microsoft Excel 2016 处理分析，结果表示为(平均值±标准差)，采用单因素ANOVA检验结合邓肯检验法进行差异性分析，P<0.05表示差异显著。采用Origin 2019软件绘制相关图表。

2 结果

2.1 珍珠龙胆石斑鱼电麻醉行为学特征

2.1.1 电麻醉时珍珠龙胆石斑鱼的行为特征

与鲶鱼[11]、鲟鱼[9]、铜鱼[12]电麻醉时的行为类似，珍珠龙胆石斑鱼在通电初始表现为快速游动、逃逸等行为，随着通电时间的增加，试验鱼逐渐僵直，鳃盖大张、背鳍竖直、侧鳍远离躯干且肌肉震颤，直至试验鱼出现侧倒或翻肚，沉入池底，进入完全麻醉状态。当麻醉电压小于100 V时，试验鱼几乎无法进入完全麻醉状态，在通电时间内，试验鱼快速游动、挣扎剧烈，电刺激期、电紧张期时间较长，电麻醉期时间短暂甚至不表现出电麻醉期的行为特征；随着电压的增加，麻醉的前两个阶段时间不断缩减，当麻醉电压为100 V左右时，绝大多数试验鱼可以进入电麻醉期进而达到完全麻醉状态，电刺激期与电紧张期的行为特征表现不明显，通电过程中偶见逃窜现象；当电压增加到130 V左右时，试验鱼大多通电初始便表现出电麻醉期的行为学特征，即鳃盖大张、身体僵直，随后直接进入完全麻醉状态。

结束通电后，在完全麻醉状态期间，试验鱼鳃盖闭合微弱且缓慢，身体僵直，侧倒于池底，对外界刺激无反应。随着时间增加，鳃动速度逐渐加快，幅度加大，尾柄摆动，对外界刺激有微弱反应。随后实验鱼进一步恢复，身体直立，鳃动正常，可以沿池壁在鱼池底部缓慢游动。此时，试验鱼在无干扰的情况下行为与未电击前几乎无差异，但相对于对照组，仍更易于捕捞，且对捕捞、采血等胁迫表现出更少的挣扎，这种表现持续12～24 h左右。

2.1.2 不同电压麻醉珍珠龙胆石斑鱼的休眠时间及存活率

在25 ℃的水温下，不同电压电击珍珠龙胆石斑鱼至完全麻醉状态后，试验鱼的休眠时间及72 h存活率如表1。从表1得，麻醉率、休眠时间与电压成正相关，其中，当电击电压为80 V时，试验鱼休眠时间为0 min，即停止通电后的试验鱼放回暂养水缸便立即恢复正常游动状态；当电击电压为100 V时，麻醉率为92%，休眠时间为17.0±3.84 min，与80 V、90 V试验组差异显著，(P<0.05)；电击电压为130 V时，试验鱼72 h存活率仅为45%。

表1 不同电压麻醉对珍珠龙胆石斑鱼的麻醉效果

2.2 不同电压麻醉对珍珠龙石斑鱼血清中酶类的影响

如图1所示，电麻醉后试验鱼血清中GOT活力呈先上升后下降的趋势，100 V、110 V、120 V试验组电击后即刻的GOT(谷草转氨酶)活力分别是35.92 U/L、39.99 U/L、46.15 U/L，3组数值均与对照组有显著性差异。相较于0 h，电麻醉后4 h各试验组珍珠龙胆石斑鱼血清中GOT活力均上升达到最大值，其中120 V试验组GOT活力最大，达53.96 U/L，与其他组别差异显著，100 V试验组血清 GOT 水平低于其他试验组；麻醉4 h之后，各试验组GOT活力均开始持续下降。

图1 不同电压麻醉珍珠龙胆石斑鱼血液中谷草转氨酶浓度的变化

如图2所示，120 V、110 V试验组的GPT(谷丙转氨酶)活力随时间增加而下降，100 V试验组的血清GPT 活力则呈先下降后上升的趋势。

图2 不同电压麻醉珍珠龙胆石斑鱼血液中谷丙转氨酶浓度的变化

试验0 h时，100 V、110 V、120 V试验组均与对照组差异显著；试验72 h时，110 V试验组的血清谷丙转氨酶活力下降至185.78 U/L，与对照组差异不显著。此时，100 V试验组 GPT 活力试验全程低于对照组，且差异显著。

如图3，各试验组的LDH(乳酸脱氢酶)活力随时间变化呈先下降后平稳变化的趋势，并且表现出电压越高，LDH活力越高的特点。0 h时，3个试验组均与对照组差异显著，且三者之间，两两对比差异显著；试验4 h时，100 V试验组LDH活力开始降低并达到对照组水平以下；试验12 h时，110 V试验组LDH活力降低至72.96 U/L，低于对照组水平；试验48 h时，120 V试验LDH活力仍显著高于对照组，110 V试验组LDH活力低于对照组且差异不显著，100 V试验组LDH活力低于对照组且差异显著。

图3 不同电压麻醉珍珠龙胆石斑鱼血液中乳酸脱氢酶浓度的变化

2.3 不同电压麻醉对珍珠龙石斑鱼能量代谢的影响

如图4所示，电麻醉后的珍珠龙胆石斑鱼的血糖呈先上升后下降的趋势，并在12 h后趋于平稳。电麻醉后4 h试验组达到血糖最大值。其中，120 V试验组血糖值最高，达到1.95 mol/L；100 V试验组血糖最低，为0.69 mol/L，与对照组无显著性差异。试验12 h时，110 V试验组血糖值与对照组无显著性差异。

图4 不同电压麻醉珍珠龙胆石斑鱼血糖的变化

电麻醉后血液中的乳酸含量变化趋势与血糖变化相类似(图5)。试验4 h时，试验组乳酸水平达到最大值，其中120 V试验组乳酸水平远高于其他组，为1.69 mol/L。随着时间的增加，各试验组乳酸含量逐渐与对照组接近。试验12 h，3个试验组乳酸水平全部低于对照组，且两两差异显著；在麻醉后的48 h，各试验组与对照组均没有显著性差异。

图5 不同电压麻醉珍珠龙胆石斑鱼血液中乳酸的变化

2.4 不同电压麻醉对珍珠龙石斑鱼皮质醇的影响

如图6所示， 电麻醉后血液中皮质醇含量与电击电压呈正相关，电压越大，皮质醇含量越高。麻醉后4 h时，皮质醇含量达到最大值，然后逐渐与对照组接近。其中，120 V、110 V试验组皮质醇水平在试验全程均高于对照且差异显著；100 V试验组在试验进行的4 h后与对照组没有显著性差异。

图6 不同电压麻醉珍珠龙胆石斑鱼血液中皮质醇的变化

3 讨论

3.1 电麻醉对珍珠龙胆石斑鱼行为学与存活率的影响

通过对珍珠龙胆石斑鱼的电麻醉试验发现，试验鱼在遭受电击时表现出明显的电刺激(快速游动)、电紧张(肌肉收缩)与电麻醉(肌肉放松)[10]。在其他条件一定时，电击电压越高，试验鱼的麻醉率越高、休眠时间越长。当电压小于100 V时，电击对珍珠龙胆石斑鱼的胁迫效应大于麻醉效应，导致石斑鱼在通电时快速窜动、剧烈挣扎，不能进入完全麻醉状态，或者休眠时间极短，甚至断电即苏醒，冯广朋等[13]对西伯利亚鲟鱼(Acipenserbaerii)也有相似的研究结果；而当电压大于120 V，除了可能出现的脏器损伤、脊椎损伤与出血[11]，还会造成鱼复苏后的生理紊乱[5]，影响试验鱼的存活率。电击后复苏的试验鱼对胁迫仍会表现出一定迟缓，且这种行为持续12～24 h，这与Bowzer等[14]对草鱼电麻醉后得到的结果相类似。

3.2 电麻醉对珍珠龙胆石斑鱼血清生化指标的影响

3.2.1 电麻醉对珍珠龙胆石斑鱼血清酶类的影响

谷丙转氨酶与谷草转氨酶主要富集在肝脏细胞中，当肝脏细胞功能正常时，血液中的两种转氨酶活性较低且较稳定[15]。因此，经常通过对谷丙转氨酶与谷草转氨酶的活力大小判断肝损伤情况。不同电压电击石斑鱼至麻醉均会导致谷草转氨酶活性显著升高，但麻醉12 h后，各试验组转氨酶活性逐渐接近对照组，100 V试验组的谷丙转氨酶活性在试验全程始终低于对照组，其他试验组在0 h时谷丙转氨酶活力显著性高于对照组，并在随后逐渐下降，表明过高的电压电击麻醉对鱼体肝脏造成一定影响。适宜的麻醉对鱼类保活过程中的心脏、肝脏损伤有减缓作用[16]，对比对照组，100 V的标准脉冲直流电电击使试验鱼在麻醉状态下进行采血操作，对鱼体的肝脏有一定保护功能，随着麻醉状态的消失，100 V试验组的谷丙转氨酶活性在8 h后随时间推移逐渐上升也证明了这一点。

乳酸脱氢酶是糖代谢途径中不可或缺的一种酶，广泛存在于各个器官内，当鱼体受到外界环境刺激或组织器官发生病变、损伤时，其相对应的机体内环境、组织器官中的 LDH 就会发生变化[17]，无氧呼吸、心肌损伤等均会引起体内乳酸脱氢酶活力升高[16]。本研究中，0 h时各试验组LDH活性的升高也可能与电击激活试验鱼体内糖的无氧酵解过程，导致参与代谢的LDH大量增多并被释放至血液中有关。与直接捕捞采血的对照组相比较，随着时间推移，除120 V试验组外，其他试验组的LDH活力均逐渐低于对照组，且100 V试验组显著性低于其他试验组，这可能表明电麻醉对珍珠龙胆石斑鱼心肌的胁迫较小，且是可逆的。在对史氏鲟鱼[18]与圆口铜鱼幼鱼[12]的电麻醉试验中也认为适当的电击对心肌几乎没有损伤。

3.2.2 电麻醉对珍珠龙胆石斑鱼能量代谢的影响

血液中的葡萄糖为鱼的各种生命活动供应能量[19]。在应激条件下，鱼体能量消耗增加，糖原加速分解，皮质醇等激素加大肝脏进行糖异生反应，使得血糖进一步提高，这种现象称为“应激性高血糖症”，广泛地出现在各种鱼类中[11,20-22]。Barcellos等[23]认为应激性高血糖反应较为灵敏且一般在出现后的24 h左右消失，因此可以利用血糖浓度辅助判断鱼类的应激大小。本研究中，110 V、120 V试验组在电击后血糖升高，与对照组差异显著，不适宜作为珍珠龙胆石斑鱼的麻醉电压。

机体血液中乳酸与血糖有着相应的关系[24]。乳酸主要在机体供氧不足时，细胞供能转变为糖酵解产生，血液中乳酸的浓度可以用来判断无氧呼吸的强度[25]。本试验中，环境溶氧充足的情况下，试验组珍珠龙胆石斑鱼血液中的乳酸可能来自受到电击产生的挣扎、肌肉紧张等短时剧烈的物理活动以及电击后，石斑鱼处于麻醉状态，缓慢微弱的呼吸。对照组试验鱼体内的乳酸则受到捕捞采血时的应激性物理活动影响。随着电麻醉效应的消失，试验组血液中乳酸水平逐渐接近对照组，这与Trushenski等[26]对鲈鱼电击后得到的血液中乳酸浓度水平变化趋势相类似。通过对试验鱼血糖水平、皮质醇含量分析，100 V电击麻醉对试验鱼的胁迫不大于对照组，同时，电击使试验鱼迅速进入完全麻醉状态，减少了试验鱼在随后人工操作时的挣扎应激，在乳酸水平上表现出较对照组的显著性优势。在针对罗非鱼(Oreochromisniloticus)[27]的电麻醉试验中也出现类似情况，即在合适的电麻参数下，罗非鱼体内乳酸浓度低于直接捕捞采血的对照组。

3.2.3 电麻醉对珍珠龙胆石斑鱼血液中皮质醇水平的影响

皮质醇被认为是鱼类应激最敏感的激素指标，在应激后的0.5～24 h内，皮质醇水平可以提升至应激前的10～100倍[28-29]。本研究中，不同实验条件获得的皮质醇浓度变化曲线相类似，均在4 h时达到最高峰，随后开始下降，类似的变化也出现在鲈鱼幼鱼[30]的电麻醉实验中；100 V试验组皮质醇浓度0 h低于对照组，4 h时略高于对照组，之后与对照组水平相当，且变化平缓，表明100 V的脉冲标准直流电电击麻醉对试验鱼的胁迫略高于直接捕捞采血，但差异不显著，更适于珍珠龙胆石斑鱼的电麻醉。

4 结论

电麻醉用时短，休眠时间长，有利于人工操作与提升运输保活过程中的品质与效率。但国内外对电麻醉的研究仍不够深入。考虑到不同个体对电麻醉的敏感度不同，目前，国内仅针对少数几种鱼进行试验，且麻醉休眠时间较短，大部分处于“断电即活”状态，没有真正进入休眠状态；美国史密斯公司研发的电麻醉设备，但未给出电麻醉具体参数，需要用户根据经验摸索，造成主观影响。本研究针对高价值海洋鱼类珍珠龙胆石斑鱼进行电麻醉，发现合理设置电麻醉的各项参数可以有效地减少电麻醉对鱼体的伤害，并同时延长休眠时间，有利于珍珠龙胆石斑鱼在养殖运输过程中的各项人工操作的开展，减少损耗。关于珍珠龙胆石斑鱼的相关电麻醉技术还需进一步研究，后续将深入开展环境温度等因素的研究试验工作，为提高珍珠龙胆石斑鱼保活流通过程的品质与效率提供参考。

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