不同来源北柴胡根色及柴胡皂苷含量相关性分析

白茹玥，高鑫媛，魏金月，李 哲，赵红玲，唐世英

（承德医学院/河北省中药研究与开发重点实验室，河北承德 067000）

2020版《中国药典》规定，药用柴胡来源于伞形科植物柴胡Bupleurum chinensis DC.和狭叶柴胡Bpleurum scorzonerifolium Wild.的干燥根，具有和解表里，疏肝解郁，升举升阳之功效[1]。柴胡中主要含有皂苷、黄酮、挥发油等成分，其主要生物活性成分和药效成分是柴胡皂苷（saikosaponins）[2-4]。在已提取出的皂苷成分中，柴胡皂苷a、c和d三种皂苷成分含量较高[3]。《中国药典》中只规定了柴胡皂苷a、d作为检测指标，然而因柴胡皂苷c具有保肝、抗癌、免疫调节等作用[5]，故本文也加入检测指标中。

目前，我国使用的含柴胡的中成药品种超过500个，各品种的组方和柴胡用量差异较大[6]。此外，由于各地用药习惯不同而导致市场流通使用的的柴胡品种良莠不齐，在一定程度上造成柴胡药材质量的难以控制。不同来源的柴胡其皂苷含量也相差甚远，有些品类甚至无法检测出皂苷成分[7]。现有观点，普遍认为野生柴胡的皂苷含量比栽培柴胡的皂苷含量高，其中根色偏深的柴胡皂苷含量更高。为探究栽培柴胡和野生柴胡之间的皂苷含量差别及柴胡根色与皂苷含量之间的关系，本研究建立了HPLC检测柴胡皂苷a、b和c含量方法，分别对不同产地的栽培柴胡及承德当地的野生柴胡进行皂苷含量测定，并对其根色和皂苷含量进行相关性分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 仪器 赛默飞UltiMate 3000超高效液相色谱仪(美国Thermo Scientific公司)，Supelco Discovery C18（4.6mm×250mm，5Di），超声波清洗器（SB-5200DT，宁波新芝生物科技股份有限公司），分析天平（SQP，德国Sartorius公司）。

1.1.2 试剂 甲醇、乙腈（均为国产色谱纯），氨水（国产分析纯），柴胡皂苷a标准品（批号：19103004，HPLC≥98%，成都普菲德生物技术有限公司），柴胡皂苷c标准品（批号：20081202，HPLC≥98%，成都格利普生物科技有限公司），柴胡皂苷d标准品（16121402，HPLC≥98%，成都普菲德生物技术有限公司），超纯水。

1.1.3 样品 在市场购买的不同产地14批北柴胡（编号1～14）以及河北省承德地区采集的野生北柴胡13批（编号15～27），经承德医学院赵春颖教授鉴定为伞形科正品北柴胡（Bupleurum chinense DC.），各样品详情见表1；根的颜色根据肉眼分辨，分为黑色根、棕色根、黄色根三种，见图1。

图1 样品根色图

表1 样品信息

1.2 实验方法

1.2.1 标准品溶液制备 分别精密称定柴胡皂苷a标准品4.012mg、柴胡皂苷d标准品5.660mg、柴胡皂苷c标准品4.120mg于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀即得柴胡皂苷标准品溶液。

1.2.2 供试品溶液制备 取柴胡药材粉末（过4号筛）0.500g，置50ml锥形瓶中，加入5%氨水甲醇溶液25ml，密闭，于30℃超声30min，过滤，用20ml甲醇分两次润洗滤渣及锥形瓶，合并滤液，回收溶剂蒸发至干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

1.2.3 色谱条件 流动相：乙腈（A）—水（B），梯度洗脱，洗脱条件详见表2；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：220nm；进样量：10μl。在此条件下，3种皂苷分离情况良好。

表2 乙腈-水梯度洗脱表

1.3 方法学考察

1.3.1 稳定性考察 精密吸取同一供试品溶液10μl，分别于0、1、2、4、8、12、24h进样，记录HPLC色谱图，柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d的色谱峰相对峰面积RSD 值分别为1.21%、1.43%、1.65%，均小于2%，表明样品在24h内稳定性良好。

1.3.2 精密度考察 精密吸取同一供试品溶液10μl，按1.2.2项方法制备供试品溶液，连续重复进样6次，分别记录3种柴胡皂苷的峰面积，其RSD值分别为0.52%、0.25%、0.84%， 表明该仪器的精密度良好。

1.3.3 线性关系考察 将对照品溶液分别稀释0.5、0.25、0.125、0.06倍，精密吸取稀释后的溶液10μl注入HPLC仪进行检测，记录峰面积，以对照品质量为横坐标，峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程见表3。

表3 线性关系表

1.3.4 重复性考察 取同一批次柴胡样品，按照1.2.2项制备供试品溶液6份，注入HPLC仪进样检测，以峰面积计算各成分含量及其RSD值。结果得6份供试品溶液中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、柴胡皂苷c的RSD值分别为1.94%、2.12%、1.87%，说明该方法重复性良好。

1.3.5 加样回收率考察 分别精密称取6份同一批次柴胡样品0.25g，分别加入柴胡皂苷a、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d对照品溶液各100μl，按1.2.2项方法制备供试品溶液，测定柴胡皂苷a、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d的含量，计算平均回收率分别为98.72%、101.28%、101.25%。

2 结果

2.1 标准品测定

根据上述实验方法进行柴胡皂苷含量测定，标准品色谱图见图2，供试品色谱图见图3，详细结果见表4。

图2 标准品样品色谱图

图3 供试品样品色谱图

2.2 样品测定

取上述27批柴胡样品，按1.2.2项方法制备供试品溶液进行测定，计算各个批次柴胡中柴胡皂苷a、d、c的含量（见表4）。可以看出，柴胡皂苷a含量最高的是甘肃康县的人工栽培北柴胡，含量为0.53%，最低的是河北省承德县的野生北柴胡，含量仅为0.03%；柴胡皂苷d含量最高的是甘肃渭源的北柴胡，含量为0.99%，最低的是河北省寿王坟镇的野生北柴胡，含量仅为0.05%；其中大部分野生北柴胡没有检测出柴胡皂苷c，栽培北柴胡均检测出柴胡皂苷c，其中含量最高的是甘肃康县的北柴胡，含量为0.15%。根据《中国药典》规定，柴胡皂苷a和d总量不得低于0.3%，在上述27批样品中，柴胡皂苷a、d总和最高的是甘肃渭源县的栽培北柴胡，含量高达1.51%，最低的是河北省承德县的野生北柴胡，含量仅为0.07%，不符合药典规定的0.3%。其中，甘肃、陕西两地的栽培柴胡的质量明显高于河北省承德市周边采集的野生柴胡，这可能与人工种植技术、柴胡生长年份有关，还需进一步实验验证。

表4 27批柴胡3种柴胡皂苷含量（%）

2.3 相关性分析

相关性分析结果详见图4。由图4可知，柴胡皂苷a含量与黄色根和黑色根呈显著性相关；柴胡皂苷d含量和棕色根和黑色根呈显著性相关，柴胡皂苷c和根色无相关性。其中黄色根的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d含量最高，随着根色的加深，柴胡皂苷a、d含量逐渐降低，而根色对柴胡皂苷c几乎无影响。

图4 根色与柴胡皂苷含量相关性分析

3 讨论

2020年版《中国药典》只规定了柴胡 Bupleurum chinensis DC.和狭叶柴胡Bpleurum scorzonerifolium Wild.作为药用柴胡来源，然而中药药理学研究发现，柴胡皂苷c不仅含量较高，还具有抗癌、保肝、提高免疫力的作用[5]。所以，加入柴胡皂苷c作为指标性成分来测定。本研究中共测定27批样品，分别来自甘肃省、陕西省、山西省、吉林省、河南省、四川省、内蒙古、河北省，分为野生采集和人工栽培两类。通过实验发现，甘肃、陕西两省栽培北柴胡皂苷含量较高，河北省周边野生北柴胡含量较低，分析原因可能是地产区环境和栽培技术手段对其质量有较大影响，所以导致其皂苷含量不高。

在市场购买中，人们普遍认为野生的、根色深的柴胡入药效果更好，然而从本实验检测结果来看，栽培北柴胡的皂苷含量明显高于承德地区野生北柴胡。无论是栽培品种还是野生品种，均是黄色根的柴胡皂苷a、d含量最高。通过实验研究发现，柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量随根部颜色的加深而逐渐减少，而根色对柴胡皂苷c含量几乎无影响。根据徐洁森等[8]对柴胡皂苷生物合成的细胞色素P450酶基因的研究初步确定，细胞色素P450基因可能参与柴胡皂苷生物合成中，本实验也侧面证明了细胞色素对柴胡有效成分皂苷的影响。

通过对柴胡的性状观察发现，人工栽培的柴胡多数偏黄色，在形态、皂苷含量上均优于野生柴胡。可进行下一步实验，以验证其细胞色素P450基因对柴胡皂苷生物合成的影响。也为柴胡质量评价标准提供新依据。