两种葱属植物柱头可授性检测

肖运强，刘俊霞，张 飞

（1.喀什职业技术学院，新疆 喀什 844000；2.克州人力资源与社会保障局）

葱属植物为多年生草本，常有葱蒜味，具圆柱状至球状鳞茎[1]。多数为优良牧草，有很高的饲用价值，对牲畜抓膘、育肥和防病、治病有重要作用[2]。我国葱属植物现今己知约有115种，主要分布在东北、华北、西北和西南地区[3]。新疆葱属植物资源丰富，是世界该属植物的起源和分布中心之一[4]，其种类约占全国葱属植物的1/2，迄今为止已知达54种、2变种，其中29种仅在我国新疆分布[3]。

棱叶韭（Allium caeruleumPallas.）为百合科葱属的植物，俗称兰花葱，其伞形花序球状，具多而密集的花，花为天蓝色[3]，生长于海拔1 140～ 2 950 m的地区，一般生于真草原、草甸草原、亚高山草甸、山地灌丛等地，国内仅分布于新疆，察布察尔、特克斯、昭苏、尼勒克、新源、木垒、阜康均有分布[5]；国外在原苏联伏尔加河下游到西伯利亚也有分布。在应用上，棱叶韭常被用作薤白的代用品，具有一定的药用价值[6]。

知母薤（Allium cernuumSchrenk.）为百合科葱属植物，花序半球形至球形，花天蓝色，具深色的脉，花丝长为花被片3/4的长度，花期为5～6月，生于荒漠、干旱海拔700～ 2 000 m草场。产于额尔齐斯河、伊犁河沿岸。哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦、塔吉克斯坦、乌兹别克斯坦也有分布。

花粉的活力与寿命、柱头的可授性为传粉生态学所必须研究的内容[7]。赵金花等[2]采用TTC法、孢粉染色法及联苯胺-过氧化氢法，从花粉活力、花粉可育性及柱头可授性方面研究了蒙古韭（Allium⁃mongolicum）、碱韭（A .polyrhizum）和细叶韭（A.tenuissimum）3种野生葱属植物的传粉生物学特征。林辰壹等[8]用MTT法和联苯胺-过氧化氢法可在田间快速检测高葶韭柱头育性。目前，国内外有关棱叶韭和知母薤繁殖规律特点研究尚未见报道。本文以葱属植物棱叶韭和知母薤为供试材料，采用不同的方法在不同时期检测棱叶韭和知母薤柱头可授性，并找出2种葱属植物柱头可授性的变化规律，为提高其繁殖数量及杂交育种和资源利用提供理论依据和参考资料。

1 材料与方法

1.1 样地概况及试验材料

试验地位于乌鲁木齐市西郊，三坪农场新疆农业大学教学实习基地葱属植物资源圃，地理位置为43°48′N，87°34′E，海拔850 m，处于准格尔盆地南缘天山前山带冲积扇平原，土壤为细砾质荒漠土。

通过田间定株观察，当棱叶韭和知母薤处于盛花期时，根据单花的开花动态，将棱叶韭分为10个时期，知母薤分为7个时期，分别取各时期的柱头进行检测可授性，具体取材标准，如表1和表2所示。

表1 棱叶韭取样标准

表2 知母薤取样标准

1.2 主要实验仪器

分析天平、烧杯、容量瓶、量筒、刀片、镊子、玻璃棒、棕色储液瓶、标签、记号笔、载玻片、盖玻片、pH试纸、便携式冰箱、白纸、荧光显微镜、带螺口盖的玻璃瓶、离心瓶、培养皿、黑布等。

1.3 药品配制

1.3.1 5 mg/L MTT法药品配制

称取0.25 g MTT，溶于50 mL浓度为0.15 mol/L磷酸氢二钾缓冲液（3.423 3 g磷酸氢二钾溶于50 mL蒸馏水，pH=7.4）中[8]。

1.3.2 联苯胺-过氧化氢法药品配制

将1%联苯胺（联苯胺0.108 2 g溶于10.8 mL 70%酒精中）、3%过氧化氢、蒸馏水按体积比为4∶11∶22的比例混合[2]、[13]。

1.3.3 苯胺蓝-荧光显微镜法药品配制

FAA固定液配制：量取37%～ 40%甲醛5 mL；45%冰醋酸5 mL；70%酒精90 mL，混合均匀。

8 mol/L NaOH溶液：称取32 g NaOH溶于100 mL蒸馏水中。

0.1%苯胺蓝溶液：称取0.1 g苯胺蓝溶于100 mL0.15 mol/L K2HPO4缓冲液（K2HPO43.423 3 g溶于100 mL蒸馏水）中[9]。

注意事项：脱色水溶性苯胺蓝溶液应提前24 h配置好，放在黑暗处保存。配好的药液应避光，放在4 ℃的冰箱内保存。

1.4 试验方法

本试验棱叶韭、知母薤柱头可授性检测主要采用MTT法、联苯胺-过氧化氢法和苯胺蓝-荧光染色法，其中，MTT法和联苯胺-过氧化氢法在三坪农场新疆农业大学教学实习基地葱属资源圃进行，苯胺蓝-荧光显微镜法在新疆农业大学园艺楼五楼显微观察室进行。

1.4.1 MTT法

具体方法：取不同花药呈现阶段棱叶韭和知母薤的柱头各20枚，将柱头置于盛有5 mg/L MTT溶液的培养皿中，每个供试柱头用药液充分浸透，放在避光的处反应10 min，若柱头具有可授性，则柱头被染成深蓝色或深紫色，颜色由浅变深，柱头可授性由弱变强。若没有可授性，则柱头没有颜色反应。

1.4.2 联苯胺-过氧化氢法

具体方法：剪取不同花药呈现阶段棱叶韭和知母薤的柱头各20枚，浸入装有联苯胺-过氧化氢反应液的培养皿中。1～2 min后观察柱头染色的部位，柱头至少2/3部位呈现深蓝色并伴有大量气泡出现认为柱头具有可授性，否则柱头没有可授性。然后计算具有可授性的柱头数量占共测柱头总数的百分率。

1.4.3 苯胺蓝-荧光染色法

具体方法：采集棱叶韭和知母薤各个时期的柱头各20枚，立即放入FAA固定液中，并置于4 ℃冰箱保存备用。柱头在荧光显微镜下观察之前，应进行软化、冲洗、染色及封片处理。软化：将材料放入8 mol/L NaOH中，软化3 h；冲洗：将软化的材料捞出，蒸馏水冲洗至少1 h，中间多次换水；染色：将冲洗后的材料放在0.1%水溶性苯胺蓝染液中4 ℃环境下染色4 h；封片：染色后的柱头放在载玻片上，用吸水纸将染液吸干，将柱头与子房分离，滴一滴甘油（丙三醇），盖上盖玻片，用铅笔上的橡皮头轻压，使花柱展开；观察：将片子放在Nikon ECLIPSE 80 i 荧光显微镜330～ 380 波段下，用10 倍镜进行观察。

1.5 数据处理

试验数据处理采用Excel软件，图片整理采用Adobe Photoshop CC软件。

2 结果与分析

2.1 棱叶韭柱头可授性

由表3和图1可知，采用MTT法，第Ⅲ时期及之前每个时期棱叶韭柱头可授性为0；第Ⅳ时期为50%，柱头开始具有可授性；第Ⅵ时期和第Ⅶ时期达到100%，柱头可授性达到最佳状态；第Ⅷ时期为85.7%，柱头可授性开始下降；第Ⅸ时期及以后时期为0，柱头不具可授性。

表3 3种方法检测知母薤柱头可授性

图1 3种方法检测棱叶韭柱头可授性

棱叶韭柱头与联苯胺-过氧化氢反应后，具有可授性的柱头变成蓝色变化并有气泡产生。第Ⅲ时期及以前时期柱头可授性为0；第Ⅳ时期为50%，柱头开始具有可授性；第Ⅵ时期和第Ⅶ时期达到100%，柱头可授性达到最佳状态；第Ⅷ时期为22.2%，柱头可授性开始下降。

荧光显微镜观察柱头可授性，发现棱叶韭在第Ⅱ时期及以前时期柱头可授性为0；第Ⅲ时期为25%柱头可是具有可授性，花粉管萌发的数量少，第Ⅴ时期花粉管萌发数量多，可授性达到100%。之后的每个时期可授性都保持平稳的状态。

2.2 知母薤柱头可授性

由表4和图2可知，知母薤柱头与MTT反应后，具有可授性的柱头变成蓝色变化并有气泡产生。第Ⅰ时期柱头可授性为0；第Ⅱ时期为25%，柱头开始具有可授性；第Ⅲ时期达到72.7%，柱头可授性达到最高；第Ⅵ时期为0，柱头失去可授性。

表4 3种方法检测棱叶韭柱头可授性

图2 3种方法检测知母薤柱头可授性

知母薤柱头与联苯胺-过氧化氢反应后柱头呈现蓝紫色，颜色由浅变深，柱头可授性由弱变强。第Ⅰ时期柱头可授性为0；第Ⅱ时期为25%，柱头开始具有可授性；第Ⅴ时期为80%，柱头可授性达到最高；第Ⅶ时期为0，柱头失去可授性。

荧光显微镜观察柱头可授性，第Ⅰ时期及以前每个时期柱头可授性为0；第Ⅱ时期为50%，柱头开始具有可授性；第Ⅳ时期达到100%，柱头可授性达到最佳状态，之后的每个时期都保持平稳状态。

3 讨论

柱头可授期是花朵成熟过程中的一个重要时期，它能在很大程度上影响自花传粉率、开花不同阶段的传粉成功率[10]。不同植物柱头可授期持续的时间从几小时到十几天不等[11]，花的年龄、一天内的不同时间以及柱头分泌物的有无等对其均有影响[12]。用MTT法和联苯胺-过氧化氢法检测柱头可授性，在很多文章中有相关报道[2]、[13-14]。本试验中，棱叶韭和知母薤在六枚花药已散粉、花被片开始闭合到花被片完全闭合出现柱头可授性的高峰，这与葱属植物高葶韭的柱头可授性表现基本一致。棱叶韭和知母薤的柱头可授期与柱头的形态特征变化密切相关，在六枚花药散粉、花被片开始闭合、柱头开始伸长过程中，柱头才具有可授性，时间较短，要充分把握柱头的可授期特点在今后育种过程中为最佳授粉期的选择提供了重要依据，保证人工驯化过程中繁殖成功[8]。

3种方法检测棱叶韭柱头可授性，用MTT法检测柱头可授性时，在第Ⅲ时期柱头不具可授性，在第Ⅵ时期出现柱头可授性高峰，一直持续到第Ⅶ时期，用联苯胺-过氧化氢法检测柱头可授性时，柱头可授性在第Ⅵ时期到第Ⅶ时期出现柱头可授性高峰，用苯胺蓝-荧光染色法检测柱头可授性时，第Ⅲ时期出现柱头可授性，第Ⅴ时期柱头可授性达到最大值，此后一直保持稳定。苯胺蓝-荧光染色法检测柱头可授性与MTT法和联苯胺-过氧化氢法检测柱头可授性的规律不同，苯胺蓝-荧光染色法检测的是花粉在柱头上萌发，花粉管从柱头经花柱到子房行走的路径，间接反应柱头的可授性，但不能说明此时柱头具有可授性。因此，柱头真正具有可授性的时间比苯胺蓝-荧光染色法检测显示的时间早。

3种方法检测知母薤柱头可授性，在第Ⅱ时期之前都未出现柱头可授性。用MTT法检测知母薤柱头可授性在第Ⅲ时期柱头可授性达到最高值，随后下降，用联苯胺-过氧化氢法检测柱头可授性，在第Ⅴ时期柱头可授性达到最高值，这与MTT法检测的结果不同，可能是由于采集柱头时出现的误差导致。用苯胺蓝-荧光染色法，在第Ⅱ时期柱头出现可授性，第Ⅳ时期可授性达到最高值，随后保持不变。这与前2 种方法检测的结果有差异，原因是苯胺蓝-荧光染色法检测的是花粉在柱头上萌发，花粉管从柱头经花柱到子房行走的路径，间接反应柱头的可授性，但不能说明此时柱头具有可授性，这与苯胺蓝-荧光染色法检测棱叶韭柱头可授性的结果一致。因此，柱头真正具有可授性的时间比苯胺蓝-荧光染色法检测显示的时间早。

4 结论

3种方法检测棱叶韭柱头可授性，在6枚花药已散粉，柱头微长于花被片，花被片半闭合（Ⅴ）到花被片完全闭合（Ⅶ）3个时期，可授性达到最高，在此期间授粉效果最佳。

3种方法检测知母薤柱头可授性，在6枚花药已散粉，柱头等于花丝，子房未膨大（Ⅲ）到6枚花药已散粉，柱头微长于花丝，花被片即将完全闭合，略干枯发黄（Ⅴ），可授性达到最高，在此期间授粉效果最佳。

3种方法中，MTT法和联苯胺-过氧化氢法方便、快捷，检测结果明显，可直接用于田间检测葱属植物柱头可授性；苯胺蓝-荧光染色法虽然检测结果准确，但易受试验成本和仪器的限制，因此检测柱头可授性时，此种方法不建议使用。