模拟含盐印染废水对菌群驯化及群落组成的影响

马嘉晗，李海红，王 玥，冯曌卓

(西安工程大学 环境与化学工程学院，陕西 西安 710048)

0 引 言

盐度的变化能引起微生物群落及代谢途径的显著变化[1-2]，适量的无机盐不仅能促进微生物生长过程中的酶反应[3]，而且能够维持膜平衡、调节渗透压。但无机盐一旦过量会影响微生物的活性，高渗透压环境会引起细胞质壁分离，破坏细胞膜和酶系统，或作用于细胞表面使其性质发生转变，高盐度对微生物的负面作用进而影响了生物反应器的处理性能[4-12]。印染废水中含有大量有毒有色物质，具有化学需氧量(COD)含量高、可生化性差、成分复杂等特点，属于典型的高盐废水，会降低水体的透明度并消耗其中的溶解氧(DO)，影响水生生物的生长，同时降低水体自净能力，破坏水体环境生态平衡，是全世界公认的最难处理的有机废水之一[13-15]，用常规的物理和化学方法难以处理。而生物处理法因其操作简单、耗能低、环境友好等优势成为修复印染废水的主要方法。由于微生物对极端环境具有较强的适应能力，能够迅速繁殖，在印染废水的生物处理中应用广泛[16-19]。

利用吸水链霉菌降解染料RB-B发现,该菌种对染料RB-B去除率高达95.27%[20]。通过微生物菌群的水解酸化作用降解含有偶氮染料RB5和RBBR的模拟印染废水，发现对2种染料的去除率均为90%，COD去除率为90%[21]。用毛皮染色废水处理活性污泥与原始污泥相比，厚壁菌门成为了绝对优势菌门(48.31%)，蓝细菌门的比例也有一定的增加，而拟杆菌门比例降低较多[22]。因此，染料对微生物群落有一定的选择性，细菌和真菌对多种稳定性较强的染料均具有较高的降解和矿化效率。本文探究不同盐度和染料质量浓度对活性污泥性能和菌群组成的影响，通过微生物群落的变化分析活性污泥对印染废水的自适应机制。

1 实 验

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料

取西安市某高校污水处理站回流污泥，在不同盐度和染料质量浓度下进行驯化筛选；按照碳氮磷比200∶5∶1的比例配制模拟废水，并控制废水NaCl质量浓度在0～20 000 mg/L之间，高压蒸汽灭菌后备用

1.1.2 试剂

葡萄糖(C6H12O6，天津市福晨化学试剂厂)；氯化钠(NaCl，天津市大茂化学试剂厂)；磷酸氢二甲(K2HPO4，天津市科密欧化学试剂有限公司)；氯化铵(NH4Cl，成都市科隆化学品有限公司)；氢氧化钠(NaOH，郑州派尼化学试剂厂)，以上均为分析纯。中性深黄GL(天津希恩思生化科技有限公司，优级纯) ；细菌基因组DNA试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)。

1.1.3 仪器

水浴恒温振荡器(SHA-C，常州德欧仪器制造有限公司)；集热式恒温加热磁力搅拌器(DF-101S，郑州市长城科工贸有限公司)；紫外分光光度计(UV-1800，上海美普达仪器有限公司)；溶解氧仪(JPB607A，(雷磁)仪电科学仪器股份有限公司)；Ph计(PHS-3C，(雷磁)仪电科学仪器股份有限公司)；COD快速测定仪(5B-3C，北京连华永兴科技发展有限公司)；消解仪(5B-1F，北京连华永兴科技发展有限公司)；氨氮快速测定仪(5B-6D(V8)，北京连华永兴科技发展有限公司)；PCR仪(ABI GeneAmp©9700型,佰乐生命医学产品有限公司)；Miseq PE300平台(Illumina公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 耐盐活性污泥驯化

1.2.2 模拟印染废水处理效果测定

1.2.3 活性污泥中的微生物群落分析

利用16S-rDNA分析不同盐度及染料质量浓度条件下菌群结构的变化。耐盐菌群基因组采用细菌基因组DNA试剂盒提取，使用Miseq PE300平台进行高通量测序并构建测序文库，将测序序列与通过 BLAST 检索 GenBank 中的核酸序列进行同源性比对，确定微生物分类地位并进行生物信息学分析。

2 结果与分析

2.1 活性污泥处理废水效率

(a) 1#反应器 (b) 2#反应器图 1 2种反应器中及染料降解趋势Fig.1 Degradation trends of and dyes in two reactors

2.2 菌落变化

基于Ace算法对不同微生物样品间的Alpha多样性进行分析，Ace算法下的各样本OTU结果如图2所示。

图 2 Ace 算法下的各样本OTU值Fig.2 OTUs of each sample with ACE algorithm

从图2可以看出，随着盐度和染料质量浓度的增加，微生物群落的生长受到不同程度的抑制，致使微生物多样性逐渐降低。驯化开始前，Y0R0样本OTU值为1 552，反应结束后，1号反应器驯化末期Y2R0及2号反应器驯化末期Y2R8样本OTU值分别为驯化前的63.3%和59.8%，表明微生物群落的多样性明显下降；Y0R0、Y1R0、Y2R0样本的OTU值与盐度呈负相关，说明盐度的提升对微生物种群具有较强的选择性，不能适应含盐环境的微生物随着盐度升高而被淘汰。同时，Y1R0的OTU值高于Y1R4，而Y2R0的OTU值也高于Y2R8，表明在同等盐度条件下，添加染料使得污水中有机物等大分子物质的增加对微生物生长产生胁迫作用，同样降低了反应体系中的微生物多样性。2个反应器中5个样本的Venn图比较分析如图3所示。

图 3 5个驯化污泥样本之间微生物种群的相似性Fig.3 Microbial population similarity between five domesticated sludge samples

1、2号反应器各自的细菌群落结构的Venn图如图3右侧所示，收集于1号反应器的3组样品OTU值为643，2号反应器的3组样品OTU值为1 603。只提升盐度的1号反应器形成的OTU值高于配合投加染料的2号反应器的相应值，说明与盐度加染料协同驯化方式相比，仅提升盐度对污泥微生物群落具有更强的选择性。

5个样品OTU值综合分析结果(图3左侧)，Y2R0、Y2R8的微生物种群OTU值分别为772、673，其中有400个OTU在所有污泥样本均能找到。虽然每个样本均含有部分独有的微生物种群，但所有驯化阶段共有的OTU值分别占到Y2R0、Y2R8样本微生物种群OTU值的51.81%和59.44%，占驯化初期污泥样本Y0R0微生物种群的27%。说明通过提升模拟废水盐度和染料质量浓度对污泥进行驯化并未导致其中微生物种群发生突变，而少数共有微生物种群经盐度和染料胁迫存活下来。

2.3 活性污泥中优势菌群

5个不同阶段污泥样本的种群发生进化树如图4所示。

图 4 科水平下的种群聚类Fig.4 Hierarchical clustering tree on family level

从图4左侧可以看出，5个样本间具有一定的亲缘关系，样本Y0R0在进化树中处于中间位置，而在驯化过程的前一阶段，Y1R0与Y1R4的微生物种群的相似度极高，属于同一个较小分支。随着反应系统盐度提升至2.0%，微生物种群组成明显改变，但由于染料的添加，Y2R0和Y2R8产生了亲缘度差异。说明随着盐度和染料质量浓度的提升，微生物种群不断发生变化；不同盐度环境下的微生物种群的亲缘度变得疏远，但并未改变污泥中的优势微生物种群；而染料的投加对污泥中的微生物具有较强的选择性。

从图4右侧可以看出，仅在反应系统中增加盐度的条件下，Saccharimonadaceae和norank_o_C10_SB1A两科菌含量均有不同程度的提高，并且Saccharimonadaceae成为优势菌群。norank_o_C10_SB1A、Caldilineaceae含量呈下降趋势；在盐度和染料质量浓度协同作用下，Propionibacteriaceae含量明显提高。经鉴定，Propionibacteriaceae为革兰氏阳性菌，其细胞壁较厚，肽聚糖含量丰富，并且含有大量的磷壁酸，可以抵抗较高的盐度冲击[23]，因此Propionibacteriaceae是高盐度和高质量浓度染料胁迫下的优势菌种。

为了更清楚地展示属水平下丰度较高种群的变化规律，绘制了5个样本在属种类下的Heatmap图(图5)。从图5可以看出，横坐标为不同盐度及染料质量浓度下的5个样本名称，纵坐标为属水平下丰度排序前10的物种。颜色从蓝色到红色渐变表示物种的丰度由小到大。横向对比发现，亲缘度较近的norank_o_PeM15和Candiidatus_Competibacter在5个样本中的丰度都较高，且未见明显变化趋势，说明其对盐度及染料质量浓度有一定的耐受能力，可以作为优势菌群处理耐盐印染废水；norank_f_Saccharimonadaceae在Y1R0、Y2R0 2个样本中丰度最高，在Y1R4、Y2R8 2个样本中丰度较低，表明该两属菌株能在盐度增长时能正常生长，但并不耐受染料驯化；Tessaracoccus在添加染料的样本中Y1R4、Y2R8丰度较高，说明该种群是无机盐和染料协同作用下的优势菌群，同时左侧的系统发育表明，该属与剩余的种群亲缘关系较远。纵向对比可以看出，Y1R0样本中10种物种的丰度都较高，而在Y2R8样本中，除Tessaracoccus、norank_o_PeM15、Candiidatus_Competibacter外，物种丰度明显降低，进一步说明盐度和染料质量浓度对微生物群落的选择性。

图 5 在属分类单元下的Heatmap图Fig.5 Heatmap under the genus taxon

3 结 论

1) 盐度和染料质量浓度对微生物有较强的选择性，不同驯化条件下的微生物群落组成差别较大，反应器中多数微生物并不能适应高盐度和染料质量浓度环境，仅有少数微生物适应并存活。

3) 活性污泥中微生物群落的多样性由于盐度和染料质量浓度的增加而显著减小，种群亲缘关系也因二者的提升而疏远。在盐度和染料质量浓度协作用下活性污泥中的优势菌属为Tessaracoccus和norank_f_Saccharimonadaceae。