头孢菌素类抗生素聚合物杂质研究进展

符雅楠 李进 尹利辉，* 冯芳 姚尚辰 许明哲

(1 中国食品药品检定研究院，北京 102629；2 中国药科大学，南京 211198)

据国家药品不良反应监测年度报告[1]、北京药物警戒[2](BPD)和解放军药品不良反应报告[3]等数据库统计，近几年来抗生素类药物依旧被归于药源性过敏反应(DIA)发生中的最常见的原因。其中，β-内酰胺类抗生素相关过敏反应以头孢菌素类抗生素为主，发生频率最高。其原因可能为头孢菌素类抗生素在国内使用率更高，且头孢菌素类抗生素的常规皮试测试敏感性低，可能不适用于预测即时的超敏反应，因此头孢菌素类抗生素的过敏反应研究值得高度重视。头孢菌素类抗生素不同于一些青霉素类抗生素，均是由天然头孢菌素C经侧链等结构改造形成的一系列半合成抗生素，因此，由发酵工艺中形成的蛋白结合物类大分子杂质可不作为研究对象[4]，聚合物杂质是引起其过敏的关键因素。

不同聚合程度的聚合物杂质一般有着相似的生物学特性，均可作为多价半抗原引起IgE介导的I型速发型过敏反应，且聚合物杂质的致敏性也会随着聚合程度的增大而增强[5-6]。因此，在之前的研究中，研究者们多采取控制聚合物杂质总量的方式对高分子聚合物杂质进行质量控制，但随着分离技术的快速发展、人们对聚合物杂质结构、反应机理、裂解规律的认识进一步加深，聚合物质控的理论也已由总量控制发展为对指针性聚合物杂质进行精准控制[7]。指针性聚合物杂质分析方法的建立目前需要运用到二维液相色谱(2D-HPLC)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)等分析技术，检测时间长、工作量较大，聚合物杂质标准物质的制备难度也较大，因此该类杂质在质控发展道路上还存在着一些挑战。本文综述了近年来该领域的发展，对头孢菌素类抗生素聚合物质控的分析方法、结构研究等趋势及进展，提出了仍需进一步思考和研究的问题。

1 头孢菌素类抗生素聚合物杂质的分析方法

1.1 葡聚糖凝胶G-10分子排阻色谱法(Sephadex G-10 SEC)

SEC法，又称凝胶色谱法(GPC)，主要依据混合物分子量大小的差异预测分离，适用于对未知样品的探索性分析。其中，β-内酰胺类抗生素聚合物杂质质控的难点之一就是聚合物杂质峰的识别问题，我国曾首次采用自身对照外标法定量，建立了Sephadex G-10凝胶色谱定量测定聚合物杂质的研究方法[8]。采用葡聚糖凝胶G-10柱，利用β-内酰胺类抗生素可于特定条件下，如水溶液中形成缔合物，在凝胶色谱系统中产生和聚合物杂质相似色谱行为的原理[9]，在杂质控制过程中可免去标准品杂质，较容易地控制聚合物杂质的总量。高丹玲等[10]采用G-10凝胶色谱系统测定了注射用头孢尼西钠中的聚合物杂质，实验结果表明聚合物杂质的有效分配系数(Kav)趋近于0，能完全排阻，验证了方法的可行性。陈霞等[11]对流动相A中缓冲盐浓度、pH和流动相B中水溶液的组分进行了方法学优化，最终建立了G-10柱测定注射用复方头孢西丁钠中聚合物杂质的分析方法。何建红[12]在采用Sephadex G-10法分析注射用头孢唑肟钠聚合物杂质时发现，药物浓度越高时，头孢唑肟钠中的聚合物杂质峰面积虽然更高，但稳定性更差，为保持实验结果的准确性，需要在配液后立即取样检测。

在采用葡聚糖G-10凝胶柱进行分离分析时，所有聚合物杂质在该色谱系统中均表现为单一的色谱峰，不具备区分不同分子量聚合物杂质的能力，可能使得某些聚合物杂质由于聚合程度小而与后面的小分子药物峰重叠，难以辨别聚合物杂质的存在[13]；此外，无论是对于剂型为干混悬剂、片剂、胶囊剂等可能添加药用高分子辅料的头孢菌素类抗生素药物还是含β-内酰胺酶抑制剂的复方制剂[11，14]，在运用G-10柱分析时，药用辅料和酶抑制剂都均有可能干扰聚合物杂质的出峰情况。其次，该方法检测灵敏度较低，进样所需的样品浓度一般比较大，药物主峰通常呈现一个超载的色谱峰，使得柱效极低。同时，一些头孢菌素类抗生素在特定条件下还会出现无法完全缔合的情况[15]，导致定量结果的不准确。

1.2 高效分子排阻色谱法(HPSEC)

HPSEC法采用以高效凝胶色谱填料作为填充剂的色谱柱进行分离，灵敏度相对较高，不需要像Sephadex G-10柱凝胶色谱法一样采用复杂的流动相体系，操作简单，具备一定程度上区分不同分子量聚合物杂质的能力。石海英等[16]选用TSK-Gel 2500PWXL柱测定了头孢克肟干混悬剂中的聚合物杂质，一定程度上解决了葡聚糖G-10色谱柱条件下由于其高分子助悬剂辅料的影响，聚合物杂质峰无法与主峰完全分离的难题。曹靖等[17]建立了TSK gel G2000SWxl凝胶系统分离分析头孢克洛分散片聚合物杂质的方法，克服了该品种在使用Sephadex G-10系统分析时时间过长，无法完全在流动相B中缔合，需寻找合适对照品的问题。张斗胜等[18]通过HPSEC法测定注射用盐酸头孢替安聚合物杂质发现采用TSK凝胶系统除了根据分子量差异进行分离，还可根据化合物的极性进行分离分析，具有类似液相色谱柱的功能。钱璟[19]在分析头孢呋辛酯片聚合物杂质时，由于该品具有脂溶性，在水中不溶，因而考虑采用流动相含可与水完全互溶的有机溶剂的TSK-gel凝胶色谱系统，方法分离效果佳，也为该类脂溶性药物提供了有效的聚合物质控手段。孙玉双等[20]建立了TSK凝胶色法测定头孢丙烯干混悬剂中的聚合物杂质含量，克服了Sephadex G-10系统对头孢丙烯产生的吸附影响。李敏等[21]采用TSK gel G2000HHR柱经筛选条件和方法学验证后建立了测定头孢妥仑匹酯片中聚合物杂质含量的方法，该方法能有效分离其聚合物杂质。熊雯等[13]比较了以葡聚糖凝胶G-10和TSK gel G2000SWxl为填充剂的两种不同的HPSEC法，测定了注射用头孢地嗪钠中聚合物杂质的含量，结果表明后者专属性好、灵敏度更高，能更全面地反映头孢地嗪钠中聚合物杂质的情况。

HPSEC法虽然较好地克服了Sephadex G-10凝胶色谱系统的不足，但因具有相似的分离机制，聚合物杂质峰易受到药物中某些小分子杂质及辅料等共出峰干扰，从而影响聚合物杂质定量的准确性。并且，凝胶介质除了具有分子排阻作用外，还会产生吸附、疏水等非排阻作用[22]，影响聚合物杂质分离的专属性。同时，还存在待分析化合物在高效分子排阻系统中的洗脱顺序不一定完全按照相对分子质量大小排列等问题。因此，随着HPSEC法的广泛应用，亟需对高效分子排阻色谱分离得到的聚合物杂质峰的专属性予以验证。

1.3 反相高效液相色谱法(RP-HPLC)

在RP-HPLC中，样品组分根据极性大小相继被洗脱。通过调节流动相组成及性质、色谱柱填充性能、柱温、流速等参数，各组分保留时间、分离能力等将得到不同程度的改善，因此该法专属性强、灵敏度高且定量准确，应是研究抗生素中聚合物杂质的首选分析方法。王建等[23]通过建立HPLC-UV梯度洗脱的方法同时测定了盐酸头孢他美酯中的有关物质和两种二聚体杂质。彭洁等[24]经筛选后采用C8柱，建立了RP-HPLC对头孢呋辛酯及其制剂中聚合物杂质的测定，并对洗脱方式及磷酸盐浓度等色谱条件进行了优化，结果显示，方法专属性强，聚合物杂质能实现较好分离。李进等[25]在进行头孢拉定原料及其制剂中的聚合物杂质研究时，对比了HPSEC和RP-HPLC两种方法。结果显示，HPSEC法测定样品中聚合物杂质含量结果不准确，而新建立的RP-HPLC法柱效更高、专属性更强，适用于头孢拉定原料及制剂的聚合物杂质相关质控，也为精准控制β-内酰胺类抗生素中的指针性聚合物杂质的分析方法奠定了基础。

但聚合物杂质峰在RP-HPLC系统中较难定位，且聚合物杂质极性一般弱于小分子杂质，通常在色谱系统中洗脱时间较长，易出现漏检的情况。因此，在利用RP-HPLC检测聚合物杂质时，方法开发方面存在着较大的难题。目前，大多数研究者在研究聚合物杂质时通常参照药典方法，查阅相关文献资料，通过试错法或单因素变量法(OFAT)对影响分离的流动相pH及缓冲盐浓度、检测波长、强溶剂比例、洗脱时间等因素进行比较摸索与优化，最终建立相对合适的检测方法。但传统的方法开发通常只能比较几个影响因素改变后产生的响应，无法预测当几个参数同时发生波动时可能存在的相互影响，也不能表征单一影响因素对分离结果的影响大小[26]，因此所建立的方法是否为最优化尚未知晓。试验设计(DOE)作为QbD应用于HPLC分析方法的建立与验证的主要手段，可同时研究多个变量因素对分离分析方法的影响及交互作用[27]。其主要步骤首先为通过析因设计或经验找到影响方法性能的关键方法因素为自变量，难分离杂质的分离度、保留情况等直接影响分离结果的指标为响应因素后，再选择合适的DOE设计模型对关键方法因素和响应值进行拟合，建立并评价统计学回归方程，从而找到“设计空间”范围内的参数最优值[28]。当前，国内外越来越多研究者采用DOE方法开发优化药物的分析方法[29-33]，该试验方法可解决传统液相分析方法开发存在的方法建立后可调控性低、方法开发效率及方法转移等方面的问题[34]，同时还可减少试验成本、缩短方法研发时间，将成为今后液相分析方法开发的一大趋势。

2 头孢菌素类抗生素聚合物杂质在国内外药典中的质控研究现状

2.1 中国药典近年来对聚合物杂质的质控现状

人们对β-内酰胺类抗生素聚合物杂质的研究始于20世纪70年代，为了对该类聚合物杂质进行更有效的质量控制，中国药典从2000年版起采用葡聚糖凝胶Sephadex G-10法对头孢他啶、头孢曲松钠、头孢噻肟钠、头孢哌酮钠这4个品种的β-内酰胺类抗生素中聚合物杂质制定了相应检测标准。随着近年来分析技术的迅速发展，中国药典不断更新并增补对不同β-内酰胺类抗生素中聚合物杂质的控制。截至目前，《中国药典》2020年版二部[35]中收载了包括青霉素类和头孢菌素类抗生素在内的一共40个品种。其中，收录头孢菌素类抗生素26个品种，48种制剂，已对其11个品种(如头孢他啶、头孢尼西钠等)采用Sephadex G-10系统制定了聚合物杂质的控制标准，2个品种(头孢地嗪钠、头孢米诺钠)采用高效凝胶色谱法控制聚合物杂质。另外，对于头孢泊肟酯和头孢唑肟钠这2个品种，最新版《中国药典》(ChP2020)分别在有关物质检查项下增加了系统适用性溶液的配制方法。其中，给出了头孢泊肟酯特定杂质的RP-HPLC参考色谱图，包括头孢泊肟酯二聚体及其异构体杂质；明确规定了头孢唑肟钠二聚体峰RP-HPLC法的相对保留时间，控制二聚体检测限度为0.1%，这将有助于今后这两类品种聚合物杂质的定位及控制。

2.2 国外药典的质控现状分析

目前，《欧洲药典》第十版(EP 10.0)[36]和《英国药典》2020年版(BP2020)[37]中分别收录19和20种头孢菌素类抗生素，并分别对头孢西丁钠、头孢泊肟酯、头孢噻肟钠这3个品种进行了含聚合物杂质的质量控制。《美国药典》43版(USP 43)[38]中收载了32种头孢菌素类抗生素，共对其中7个品种(头孢丙烯、头孢呋辛酯、头孢羟氨苄、头孢噻肟钠、盐酸头孢吡肟、头孢噻呋钠、盐酸头孢噻呋)的聚合物杂质进行了控制。从各国药典方法中得知，国际上一般采用反相高效液相色谱梯度洗脱法对聚合物杂质进行控制，以相对保留时间对其进行初步定位，将二聚体作为主要特定杂质进行质量控制，但对于聚合物杂质的质控限度暂没有规定统一的标准(表1)。

表1 国外药典控制聚合物杂质的限度要求Tab.1 Limit requirements for polymer impurities in foreign pharmacopoeias

《中国药典》收录的采用葡聚糖G-10系统控制聚合物杂质的方式填补了之前国际上聚合物杂质质控标准中的一项空白，但目前看来，该法对各品种聚合物杂质限度确定较为笼统，在实际药品检查中仍有需要解决的问题[39]，将无法满足今后质控的需求。同时，后增补的高效凝胶色谱法虽在一定程度上提高了聚合物杂质检测的灵敏度，其方法专属性也已逐渐受到质疑[40-41]。在解决聚合物杂质定位难题之后，RP-HPLC法将有望成为聚合物杂质控制的主要分析方法。

2.3 原料药及制剂在聚合物杂质质控中的异同及进展

国内外药典收载的头孢菌素类抗生素品种中，聚合物杂质控制标准多以原料药和注射剂为主。原料药成分单一较易控制，而注射剂剂型较为特殊，冻干药品经溶解后直接注射入人体组织或血管或器官内吸收速度快，起效迅速。特别是静脉注射，药物可直接进入血液循环，因聚合物杂质而引发过敏性反应的几率较其他制剂更大，需要严格控制该类制剂聚合物杂质限度[5，42]。相对于原料而言，其他制剂如干混悬剂[16]、胶囊剂、分散片剂[17]等剂型中通常含有高分子辅料，若采用分子排阻G-10法，可能会出现聚合物杂质和高分子辅料共出峰的情况，在对该类制剂进行质量控制时，应重点排除辅料的干扰。

复方制剂的聚合物杂质检测则更为复杂，β-内酰胺类抗生素复方制剂多为含β-内酰胺酶抑制剂的制剂，不仅增强了抗菌活性、扩大了抗菌谱，还能从一定程度上解决细菌的耐药性问题[43]。但研究发现，在对此类复方制剂进行杂质谱研究时，杂质生成速度较单方制剂更快，且可能有仅在复方制剂中检出的新未知杂质产生[44]。尽管实验表明，目前并未发现β-内酰胺酶抑制剂自身聚合杂质及β-内酰胺类抗生素与β-内酰胺酶抑制剂之间发生聚合的聚合物杂质产生[45-46]，但β-内酰胺酶抑制剂的存在是否会影响β-内酰胺类抗生素产生聚合物杂质的含量、聚合程度和杂质保留行为，以及通过何种途径促使β-内酰胺类抗生素的降解仍有待于进一步的研究。

3 头孢菌素类抗生素聚合物杂质的结构研究

3.1 质谱法(MS)

MS技术的应用，让研究者们对聚合物杂质的复杂结构有了更深入的认识。李曼琳等[47]采用LC-MS技术，通过飞行时间质谱(TOF/MS)和三重四级质谱(MS/MS)分别测定头孢妥仑匹酯中主要有关物质的准确质量和子离子特征，最终共鉴定出10个主要有关物质，其中包括头孢妥仑匹酯二聚体和开环二聚体杂质，与其他有关物质相比，该类杂质对反应温度和时间更为敏感。蒋惠源等[48]通过超高效亲水性液相色谱-电喷雾四极杆飞行时间串联质谱法，对头孢泊肟酯中的一个二聚体进行了结构推测，经裂解途径和高分辨质谱数据验证推断，该二聚体为两分子的头孢泊肟酸经L型聚合反应形成。侯玉荣等[49]建立了高效液相色谱串联离子阱-飞行时间质谱(HPLCUV-IT-TOF)的方法对头孢噻肟钠进行了杂质谱研究。对于无对照品的未知杂质的结构鉴定(如聚合物杂质等)，通过采用已知结构化合物如头孢噻肟为模型，分析已知结构物质与未知杂质多级质谱行为的异同性，从而推定其化学结构。其中，样品中检出6个二聚体杂质，为采用RP-HPLC控制该品种的聚合物杂质及其结构研究提供了思路。但是，聚合物杂质存在多种聚合位点和方式，较为复杂，且在聚合过程中易产生多种手性异构体，而通过质谱图、推断质谱裂解规律进行结构解析只能初步推测聚合物杂质的平面结构，聚合位点以及立体化学结构还有待通过其他波谱学方法进一步确证。

3.2 核磁共振技术(NMR)

NMR法是表征化合物结构的重要手段，也是揭示聚合物杂质反应机理的工具之一。Xia等[50]在不同浓度、不同pH值和不同温度下对比阿培南进行了强制降解实验。采用RP-HPLC和LC-MS/MS法对降解产物进行了鉴定，最后通过反相制备HPLC得到了一种二聚体杂质，结合NMR法对其进行了表征，并提出了比阿培南可能的降解途径。王丹丹等[51]通过制备液相法成功制备分离出了盐酸头孢他美酯原料药中含量较大、分离度相对较高的3个杂质，并采用NMR法确证了其化学结构，其中包括两个合成副产物和一个高分子二聚体杂质。但由于聚合物杂质的不稳定及结构复杂性，目前几乎尚未系统性地对其进行结构确证。然而，聚合物杂质对照品的获得和结构确证对提高头孢菌素类抗生素聚合物杂质控制至关重要，因此也是接下来的聚合物杂质研究工作中亟须解决的问题之一。

3.3 二维高效液相色谱法(2D-HPLC)

2D-HPLC法能将两根互相独立的色谱柱进行串联，使得样品组分可以在两个不同的分离系统下进行分离。运用2D-HPLC技术，可实现SEC法与RPHPLC法在线分析的无缝衔接[52]，也为聚合物杂质结构研究中因聚合物杂质峰定位困难而带来的繁重工作量提供了解决方案。谭洪泉等[53]建立高效凝胶色谱法(HPGPC)法并联合RP-HPLC法，利用两个色谱系统的互补性对样品在高效凝胶色谱系统中的未知来源杂质(包括聚合物杂质)进行了归属，解决了聚合物杂质在RP-HPLC中保留时间较长，可能出现漏检等问题。秦峰等[54]运用在线二维凝胶色谱反相液相色谱法分别对Sephadex G10和TSK高效凝胶系统中主峰前的洗脱馏分进行了切换分析，成功将凝胶色谱法与指针性杂质的定位结合起来，并联用质谱技术对致敏性聚合物杂质的结构进行了初步推断。阮昊等[55]采用二维液相色谱-质谱联用技术对注射用阿洛西林钠的聚合物杂质进行定位分析和结构鉴定，在反相高效液相色谱上定位出了4种聚合物杂质，并分别推导出其可能的化学结构。

3.4 LC/MS-柱切换技术

在分离分析头孢菌素这类抗生素时，配制流动相通常需要用到磷酸盐等非挥发性盐类成分。由于非挥发性缓冲盐进入质谱检测器后会导致灵敏度降低，分离效果变差，污染质谱系统[56]。因此，在利用质谱技术对目标聚合物杂质进行结构鉴定时不适合直接利用LC-MS法进样分析，操作烦琐。采用柱切换LC-MS联用技术，可实现在切换色谱系统前对流动相进行在线脱盐，避免在不同色谱系统中因更换流动相而导致目标杂质保留时间发生变化而无法准确定位，既节省了时间也能够保证杂质定性的准确性。由于《中国药典》2015年版中注射用头孢美唑钠有关物质检测方法的色谱系统中含有不挥发性的离子对试剂四丁基氢氧化铵，无法直接采用LC-MS法进样分析，李进等[57]通过柱切换-LC/MSn技术对该制剂中的目标杂质进行了富集、脱盐预处理及质谱分析，更为快速、简便地推定了其主要杂质峰结构。胡卫国等[58]采用改良亲水凝胶色谱柱(Cef-SEC)分析了头孢硫脲中的聚合物杂质，并运用在线脱盐-高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱技术(2D-LC-IT-TOF/MS)对聚合物杂质进行了鉴定。柱切换系统中1D色谱条件和2D色谱条件通过一组共用的馏分收集环进行连接，通过控制程序进行时间切换来捕集目标化合物，可在不改变流动相条件的基础上实现了杂质的切换分离。在鉴定杂质结构的同时，又实现了对1D-HPLC色谱图中聚合物杂质的定位。此外，近年来，随着聚合物杂质控制的迫切需要，李进等还通过柱切换-LC/MSn技术分别对阿莫西林克拉维酸钾[59]、哌拉西林他唑巴坦钠[46]、头孢拉定[25]、头孢噻肟钠[40]、头孢他啶[41]、头孢地尼[60]、头孢克肟[61]和头孢盐酸甲肟[62]等多种β-内酰胺类抗生素原料及制剂中的聚合物杂质进行了研究，极大地推动了聚合物杂质的结构研究，为聚合物杂质的结构确证奠定了坚实的基础。

4 计算化学在探寻聚合规律中的应用

聚合物杂质存在多种聚合方式和位点，之前的研究中，研究者认为β-内酰胺类抗生素主要存在两种聚合方式，分别为发生在母核的N型聚合反应和发生在侧链的L型聚合反应。但两种聚合方式的得出仅是根据多年实验经验、质谱等手段初步推断，并未得到系统确证。因此，研究并确证不同种类β-内酰胺类抗生素中聚合物杂质的聚合方式仍是质控路上的关键及难点之一。只有在明确聚合物杂质的聚合位点规律之后，才能真正做到对不同聚合程度的杂质进行精准指针性控制。

日前，随着计算化学的飞速发展，使得从理论体系的角度对复杂化合物的反应趋势进行一定水平上的指导及预测成为了可能。伍启章[63]首次利用计算化学，通过量子化学软件模拟了几种代表性青霉素类抗生素的不同聚合位点的化学反应途径，比较了它们反应前后的能量变化和反应限速阶段的活化能，推测聚合反应发生的难易程度，从理论上解释优势聚合产物的存在。然后分别选取部分厂家的原料药和注射粉针剂进行检测，在柱切换体系下，采用液质联用方法分析并验证了各种二聚体聚合位点的倾向性。研究表明，青霉素类抗生素根据6位侧链上有无自由氨基，共有4种可能的结合位点，分别为β-内酰胺环之间的聚合，β-内酰胺环开环与2位羧基侧链的结合(N型聚合反应)；β-内酰胺环与6位侧链活泼氨基的聚合，6位侧链活泼氨基与2位羧基侧链的结合(L型聚合反应)。以上4种反应途径理论上均可以发生，但因反应的活化能不同，反应难易程度不尽相同，最终形成或检出的优势聚合产物也可能只有一种。

头孢菌素类抗生素β-内酰胺六元环3位多有侧链存在，聚合物杂质的结合位点规律研究较青霉素类抗生素更为复杂。在对该类抗生素进行聚合位点分析时，可按照头孢菌素类抗生素3位有无侧链及氨基侧链，7位侧链有无氨基结构或氨噻肟结构将头孢菌素类抗生素分为6大类[64]。因其7位侧链可能存在氨噻肟中活泼氨基基团或游离氨基基团、3位可能具有氨基侧链等聚合反应进攻位点，因此可能的聚合位点也更为多样。对该类抗生素聚合反应的机制进行深度探索的思路仍是需要通过计算化学软件从化学反应原理上进行理论推断后通过柱切换-LC/MSn、NMR等技术手段进行结构确证，最终确定聚合规律。

5 思考及展望

β-内酰胺类抗生素聚合物杂质稳定性极差，出峰情况复杂，兼具多种手性异构体和开环类副产物，因此，其杂质对照品的结构确定和制备仍是目前的一大挑战。针对此问题，首先要对聚合反应的机制进行深度探索，通过量子化学软件从原理上总结并分析各类β-内酰胺类抗生素聚合物杂质的聚合位点和取代机理，找寻聚合物杂质的聚合规律。通过质谱技术获知杂质可能的结构及杂质来源后采用反合成技术和富集杂质后采用制备液相技术是目前常见的杂质制备方法。但考虑到合成成本、制备效率等问题，着眼于强降解样品溶液对聚合物杂质进行富集，通过制备型液相色谱分离纯化目标杂质，并采用核磁共振技术确证结构的方式[65]，将具有更大的现实意义。

实践证明，RP-HPLC法应是β-内酰胺类抗生素聚合物杂质质控中更为理想的分析方法。2D-HPLC及柱切换LC-MS技术已经解决了目前所存在的聚合物杂质定位困难的问题，但液相方法的开发与优化仍是需要进一步探究的重点，以QbD理念中的DOE手段为突破口，利用统计学原理筛选最优化方法将是今后复杂化合物分析方法建立的一大趋势。其次，只有在了解最有利于聚合物杂质产生的具体条件，如确切的放置时间、温度范围、溶剂pH等后，才能更加明确头孢菌素类等β-内酰胺类抗生素的最佳生产环境、贮存条件和使用途径，解决聚合物杂质制备过程中杂质不稳定、浓度过低等难题，因此，也是亟须解决的一大问题。

最后，大量文献表明，归属于青霉素类抗生素的氨苄西林、阿莫西林，因其6位侧链上存在自由氨基，更易成为进攻位点与另一分子β-内酰胺环发生聚合[59，66]。研究者[63]也通过计算化学软件模拟后发现，氨苄西林的聚合反应过程从热力学角度来说属于放热反应，相对于其他青霉素类抗生素而言可在相同降解条件下产生更多数量的聚合物杂质，有利于聚合物杂质的结构等研究。目前，国内外药典均已收载有关这类药物的聚合物杂质质控标准。而对于头孢菌素类抗生素，研究表明，其C7位的R1侧链与青霉素的C6位侧链结构相同或相似是导致交叉过敏反应的关键原因[67]。同理，头孢氨苄7位侧链上也有游离氨基的存在，同时β-内酰胺环3位无活性侧链干扰，推测该品种与氨苄西林相似易发生聚合反应。但值得注意的是，头孢氨苄聚合物杂质的有关研究及其在实际药物中是否威胁着公众的用药安全却鲜有报道。因此，后续研究将以头孢氨苄等7位含有游离氨基的头孢菌素类抗生素为切入点，深入探讨该类聚合物杂质的确切结构和聚合规律。在今后的聚合物杂质结构研究中，总结并归纳具有不同结构特征的头孢菌素类抗生素生成聚合物杂质的难易程度，将有利于形成控制指定品种聚合物杂质的策略，在保证公众用药安全的同时，提高聚合物杂质控制的效率，节约质控成本，将具有重大意义。同时，也可为将来的聚合物杂质致敏性研究奠定基础。