3种盐胁迫对桂桑优12种子萌发特性的影响

陈家力，姜 喜，谭占明，杨明禄，肖海兵

(1.塔里木大学园艺与林学学院，新疆阿拉尔 843300；2.塔里木大学农学学院，新疆阿拉尔 843300)

0 引 言

【研究意义】盐碱胁迫是影响植物生长发育的一个重要非生物胁迫因素[1]。目前，我国盐渍土面积约为3.49×107hm2[2]，由于多种因素影响，其面积不断增加[3]。新疆盐渍化现象尤为严重，盐渍土面积占新疆耕地总面积的32%，且混合盐碱土土壤盐分组成复杂，限制了土壤的有效利用[4]。选育并种植一些适合新疆盐碱化土壤改良的植物势在必行[5]。桑树(Morusalba)是桑科桑属，落叶乔木或灌木，中国东北至西南各省区，西北直至新疆均有栽培；具有适应性强、生长迅速、寿命长、根系发达等林木特点，能较好的净化空气、保水固土防沙、改良土壤等明显的生态功能[6]，其经济价值、营养、等方面具有鲜明的特色[5]。桂桑优12是广西优良的杂交桑树品种，具有发芽早，发芽能力强，群体整齐，生长旺盛，节间较密，叶片较大，叶肉较厚，产叶量高，蛋白含量高，叶质好等优良特性，种子可直播建园，1年内多次收割，抗旱、再生能力及适应性较强[7]，适合用于常年干旱及盐碱化严重地区的植被恢复[8]，是有效利用和修复盐碱地生态环境的优良树种[9]。新疆桑树分布广泛，具有抗旱、抗盐碱、抗寒等特性，如新桑8号抗旱、抗寒都很高，产叶量较低，适合在南疆边缘荒漠化地区进行推广种植，防风治沙，改良土壤[10]，而桂桑优12在产叶量、粗蛋白含量及抗盐、抗旱性上都占有优势，在新疆麦盖提县沙漠、民丰县沙漠边沿土地试种且长势良好，是石漠化治理和高蛋白牧用型饲料桑的首选桑树品种[7]，为此，利用盐渍土进行大面积种植桂桑优12优良桑树品种，将桑树生产与盐渍土改良全面结合起来，不仅有利于新的高蛋白饲料资源开发，还能缓解新疆畜牧业饲料短缺的现状[10]，对生态效益和经济效益的发挥具有重要意义。【前人研究进展】在盐碱化土壤中，种子萌发是植物生长的关键期和敏感阶段，是幼苗成功建植的关键，也是植物生长发育的前提[11]。有研究对甜玉米[12]、小麦[13]、绿豆[14]、紫花苜蓿[15]等开展了盐胁迫方面的研究，认为一定范围内的盐胁迫能促进植物种子萌发，高浓度的盐胁迫抑制种子萌发。班月圆等[16]研究认为，桑树具有在盐碱地治理中开发应用的潜力。周象海等[17]指出在100 mmol/L NaCl胁迫下桂桑优12种子的萌发受到明显抑制。闫晶秋子等[18]发现随着盐浓度的增加，蒙桑幼苗丙二醛(MDA)含量、可溶性蛋白质、游离脯氨酸含量均显著上升，这和林天宝等[19]的研究结果一致，还发现桂桑优12耐盐性最强。祝娟娟等[20]研究测得河南桑和粤桑耐盐临界值分别为0.54和0.62 mmol/L。【本研究切入点】在桑树盐胁迫研究中，多以不同浓度的单盐NaCl为胁迫条件，从不同桑树品种种子萌发特性[21,22]、幼苗生长和生理变化[23,24]及耐盐转运蛋白基因表达[25]等进行了相关研究，而关于混合盐对桑树种子萌发和其耐盐性研究还不够充分，特别是有关碱性混合盐(NaCl+Na2CO3)和中性混合盐(NaCl+Na2SO4)胁迫对桑树种子萌发及其生理的影响相关报道较少。研究不同盐胁迫对桂桑优12种子萌发的影响，分析其对不同盐胁迫的耐受性，为新疆桑树引种和推广提供理论依据。【拟解决的关键问题】以桂桑优12种子为试验材料，采用碱性混合盐、中性单盐、中性混合盐的不同浓度的盐溶液处理桑树种子，研究不同盐浓度对桑树种子萌发的影响及生理变化，综合评价桂桑优12种子对3种盐的耐受能力，旨为研究桂桑优12对盐碱胁迫的适应能力、耐盐品种选育提供理论依据，为其种子在盐碱地的播种及栽培提供了一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

桂桑优12种子由新疆和田蚕桑科学研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

采用3种盐溶液处理桂桑优12种子，盐溶液分别为中性单盐NaCl、碱性混合盐NaCl +Na2CO3、中性混合盐NaCl + Na2SO4，每种盐溶液分别设置6个浓度梯度，其中Na+浓度分别为：0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mol/L。选取籽粒大小一致的桂桑优12种子，用0.3%的高锰酸钾溶液消毒15 min，用蒸馏水冲洗干净，将种子置于提前铺有2层滤纸的培养皿中，每个培养皿放置50粒种子，分别加入不同浓度的盐溶液，每处理3次重复，以蒸馏水处理组作为对照；将培养皿置于25℃的培养箱中进行培养，每天更换处理液，观察并记录种子发芽数；发芽结束后统计种子发芽率，每处理随机挑取30粒发芽种子测量根长和苗高。表1

表1 各处理的成分及盐分浓度Table 1 The composition and salt concentration of each treatment

1.2.2 测定指标

1.2.2.1 种子基本特征

从挑选好的纯净种子中选取10个重复，每个重复100粒种子，各重复分别用万分之一电子天平称重，各重复重量的平均值乘以10，得出种子的千粒重。将纯净种子均匀混合，随机选取30粒，用游标卡尺测量每粒种子的最大长度、宽度和厚度。

1.2.2.2 种子萌发特性

发芽率是指萌发种子数占供试种子数的百分比，发芽势是指达到种子萌发高峰时萌发种子数占供试种子数的百分比，发芽指数是指日发芽数与发芽天数比值之和，活力指数是指发芽指数与萌发种子干重的乘积，干重在发芽结束后测量每个处理发芽种子的干重。

发芽率(%)=种子萌发数/供试种子数×100%；

发芽势(%)=达到萌发高峰种子萌发数/供试种子数×100%；

活力指数=发芽指数×萌发种子干重。

1.2.2.3 种子萌发生理指标测定

游离脯氨酸含量采用酸性茚三酮显色法[26]测定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸比色法[26]测定。

1.2.3 隶属函数法对其耐盐性进行综合评价

采用模糊数学中的隶属函数法[27]，隶属函数法的具体公式如下：

X(μ) =(X-Xmin)/(Xmax-Xmin).

(1)

X(μ) =(Xmax-X)/(Xmax-Xmin).

(2)

式中：X(μ) 为隶属函数值，X为某一指标的测定值，Xmin、Xmax分别为某一指标的最小值、最大值。如果抗性指标与抗性呈正相关用(1)式，反之用(2)式。

1.3 数据处理

数据整理与初步处理采用Excel 2007进行，盐胁迫下不同指标的多重比较采用R语言“agricolae”程序包“LSD.test”函数进行处理分析的，盐胁迫下不同指标单因素比较图采用R语言ggplot2程序包进行绘制的；桂桑优12种子发芽率与盐浓度回归分图采用R语言plot函数进行绘制的。

2 结果与分析

2.1 桂桑优12种子基本特性

研究表明，桂桑优12种子近扁圆形，成熟后为黄褐色。该品种种子长95%置信度的区间是0.238～0.25 cm, 平均为(0.244 ± 0.016) cm；种子宽95%置信度的区间是0.185～0.199 cm, 平均为(0.192 ± 0.019) cm; 种子厚95%置信度的区间是0.131～0.142 cm, 平均为(0.136 ± 0.015) cm;千粒重95%置信度的区间是2.159～2.179 g, 平均为(2.169± 0.026) g。桂桑优12种子中千粒重变异系数最小，达1.21%；种子厚度的变异系数最大，为11%，桂桑优12种子千粒重变异程度小，种子厚度的变异程度比较大。表2

表2 种子基本特性Table 2 Basic characteristics of seeds

2.2 3种盐胁迫对桂桑优12种子萌发特性影响

2.2.1 3种盐胁迫对桂桑优12种子发芽率影响

研究表明，3种盐溶液处理对桂桑优12种子的发芽率均有一定抑制作用，桂桑优12种子在3种盐胁迫下，随着盐浓度的升高发芽率均呈下降趋势。对照处理的发芽率最高为88%；而低浓度的盐溶液对种子发芽率的影响不大，中性混合盐0.025、0.05 mol/L的处理与对照无显著差异(P>0.05)，其它浓度处理的发芽率显著的低于对照(P<0.05)，中性单盐、碱性混合盐0.025 mol/L的处理与对照差异不显著(P>0.05)，其它浓度处理的发芽率显著的低于对照(P<0.05)。碱性混合盐、中性单盐和中性混合盐在0.25 mol/L浓度处理下桂桑优12种子的发芽率均为最低，分别为12.67%、24.67%和25.33%。图1

2.2.2 3种盐胁迫桂桑优12种子发芽势的影响

研究表明，桂桑优12种子的发芽势随着3种盐浓度的变化趋势与发芽率类似，随着3种盐浓度的升高种子的发芽势均呈下降趋势；对照处理的发芽势最高为75.33%，显著的高于3种盐溶液处理的发芽势；3种盐溶液在高浓度0.2、0.25 mol/L时对桂桑优12种子发芽势的影响差异不显著；碱性混合盐、中性单盐、中性混合盐在0.25 mol/L浓度处理下桂桑优12种子的发芽势为对照组的13.72%、16.81%、18.58%。图2

注：数据是3次重复的平均值士标准误差。图中不同字母代表差异性显著(P<0.05)。下同

图2 盐胁迫下桂桑优12种子发芽势Fig. 2 Germination potential of mulberry seeds under salt stress

2.2.3 3种盐胁迫对桂桑优12种子发芽指数的影响

研究表明，随着3种盐浓度的升高，桂桑优12种子的发芽指数均呈下降趋势。低浓度的盐溶液对种子发芽指数的影响不大，碱性混合盐0.025 mol/L的处理与对照无显著差异(P>0.05)，其它浓度处理的发芽指数显著的低于对照(P<0.05)，中性单盐0.025、0.05 mol/L的处理与对照差异不显著(P>0.05)，其它浓度处理的发芽指数显著的低于对照(P<0.05)；中性混合盐0.05 mol/L的处理与对照差异不显著(P>0.05)，其它浓度处理的发芽指数显著的低于对照(P<0.05)；碱性混合盐和中性混合盐0.2、0.25 mol/L 2个处理差异不显著。桂桑优12种子在对照处理下发芽指数最高为8.2，碱性混合盐、中性单盐、中性混合盐在0.25 mol/L浓度处理下桂桑优12种子的发芽指数为对照组的13.41%、25.55%、33.12%。图3

图3 盐胁迫下桂桑优12种子的发芽指数Fig. 3 Germination index of mulberry seeds under salt stress

2.2.4 3种盐胁迫对桂桑优12种子活力指数的影响

研究表明，随着3种盐浓度的升高桂桑优12种子的发芽势均呈下降趋势。桂桑优12种子对照组的活力指数最高为0.84，显著高于3种盐溶液处理。中性单盐、中性混合盐0.15、0.2、0.25 mol/L的处理间桂桑优12种子活力指数差异不显著，碱性混合盐0.1、0.15、0.2、0.25 mol/L处理间差异不显著(P>0.05)；碱性混合盐、中性单盐、中性混合盐在0.25 mol/L浓度处理下桂桑优12种子的活力指数为对照组的3.12%、6.05%、8.22%。图4

图4 盐胁迫下桂桑优12种子活力指数变化Fig. 4 Vigor index of mulberry seeds under salt stress

2.3 3种盐胁迫对桂桑优12种子萌发生理特性的影响

2.3.1 3种盐胁迫对桂桑优12种子游离脯氨酸含量的影响

研究表明，随着3种盐浓度的升高桂桑优12种子的游离脯氨酸含量呈上升趋势。3种盐溶液在0.025 mol/L的浓度处理与对照组差异不显著，其它浓度处理均显著高于对照组；碱性混合盐0.2、0.25 mol/L 2个处理间差异不显著，中性混合盐0.15、0.2、0.25 mol/L 3个处理间差异不显著；中性单盐0.25 mol/L处理显著高于其它处理。对照组游离脯氨酸含量为0.033 4%，碱性混合盐、中性单盐、中性混合盐0.25 mol/L处理游离脯氨酸含量为对照组的12.59、10.65和12.24倍，且游离脯氨酸含量由大到小依次为碱性混合盐>中性混合盐>中性单盐。图5

图5 盐胁迫下桂桑优12种子游离脯氨酸含量变化Fig.5 Free proline content of mulberry seeds under salt stress

2.3.2 3种盐胁迫对桂桑优12种子丙二醛含量的影响

研究表明，随着3种盐浓度的升高桂桑优12种子的丙二醛含量呈上升趋势。3种盐溶液在0.025 mol/L浓度处理的丙二醛含量与对照组差异不显著，其它浓度处理的丙二醛含量均显著高于对照组；碱性混合盐0.1、0.15、0.2、0.25 mol/L 4个处理间差异不显著，中性单盐0.15、0.2、0.25 mol/L 3个处理间差异不显著；中性混合盐0.2、0.25 mol/L 2个处理间差异不显著。对照组游离脯氨酸含量为0.020 7 mg/g，碱性混合盐、中性单盐、中性混合盐0.25 mol/L处理游离脯氨酸含量为对照组的4.27、4.75和6.31倍。图6

图6 盐胁迫下桂桑优12种子丙二醛含量变化Fig. 6 Malondialdehyde content of mulberry seeds under salt stress

2.4 桂桑优12种子萌发对3种盐的耐受范围

2.4.1 桂桑优12种子发芽率与盐浓度回归分析

研究表明，3个回归方程的相关系数均在0.96以上，桂桑优12种子发芽率与盐浓度间的回归关系显著。图7

2.4.2 桂桑优12种子萌发对3种盐的耐受范围

研究表明，在碱性混合盐胁迫下，桂桑优12种子萌发的适宜浓度为0.043 1 mol/L，耐盐极限浓度为0.252 4 mol/L；在中性单盐胁迫下，桂桑优12种子萌发的适宜浓度为0.040 8 mol/L，耐盐极限浓度为0.295 9 mol/L；在中性混合盐胁迫下，桂桑优12种子萌发的适宜浓度为0.036 4 mol/L，耐盐极限浓度为0.290 5 mol/L。表3

图7 发芽率与盐浓度的回归Fig. 7 Regression analysis of germination rate and salt concentration

表3 桂桑优12种子萌发对3种盐胁迫地耐受范围Table 3 Tolerance range of mulberry seed germination to three salt stresses

2.5 桂桑优12种子对3种盐耐性的综合评价

研究表明，各项指标的隶属函数值最高的均为中性混合盐，除发芽势外隶属函数值最低的均为碱性混合盐，发芽势隶属函数值最低的是中性单盐；桂桑优12种子萌发对碱性混合盐、中性单盐、中性混合盐3种盐胁迫抗性的综合评价值分别为：3.565、3.905、5.027；3种盐溶液对桂桑优12种子萌发的胁迫，最严重为碱性混合盐(NaCl+Na2CO3)，最轻的为中性混合盐(NaCl+Na2SO4)。表4

表4 桂桑优12种子萌发对3种盐胁迫耐受能力的综合评价Table 4 Comprehensive evaluation of the tolerance of mulberry seed germination to three kinds of salt stress

3 讨 论

种子萌发是指渡过休眠期的种子在适宜的环境条件下，吸水膨胀，有机物质分解，胚开始生长，胚根突破种皮的过程[28]。种子萌发是植物生长过程中对盐胁迫最为敏感的阶段，植物是否能在盐碱环境中正常生长，主要取决于它能否发芽、发芽率的高低以及发芽势和发芽指数等[29,30]。研究分析了桂桑优12种子在中性单盐(NaCl)、碱性混合盐(NaCl+Na2CO3)和中性混合盐(NaCl+Na2SO4)胁迫下发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数等指标的影响，结果发现，3种盐胁迫均能抑制桂桑优12种子的萌发，其种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数随着盐溶液浓度的升高不断下降，这与张国英[21]、闫晶秋子[18]等在桑的研究结果一致。不同植物种子萌发对盐分胁迫的响应是不同的，主要有增强效应、减弱效应和完全阻抑效应3个方面。研究中，盐胁迫抑制了桂桑优12幼苗有机物质的积累，使幼苗生长变缓，幼苗干重降低，种子活力降低，其根系生长明显受抑制，根系呈细小、发黄、须根少的状态，这可能与离子毒害、抑制细胞的生长和分裂有关[31]。研究还发现，3种盐的浓度一旦超过耐盐极限浓度0.25 mol/L后，种子无法萌发，其原因可能是高浓度盐破坏了种子的一部分细胞膜，使细胞膜对物质选择性透过功能及控制膜内外物质交换功能丧失，影响了桂桑优12种子的整个萌发进程。

赵东晓等[23]，闫晶秋子等[18]研究认为盐处理中桑树中的脯氨酸含量随着盐浓度的增加和盐胁迫时间的延长呈上升趋势，与研究结果的规律基本一致，说明在盐胁迫环境下，桂桑优12种子利用渗透调节物质的积累来调节和平衡体内的渗透压，以缓解盐胁迫带来的不利影响。研究发现3种盐溶液在0.025 mol/L的浓度处理与对照组差异不显著，其它浓度处理均显著高于对照组；碱性混合盐、中性单盐、中性混合盐0.25 mol/L处理游离脯氨酸含量为对照组的12.59、10.65和12.24倍，盐浓度达0.25 mol/L，细胞发生渗透，游离脯氨酸的积累量也达最大，可能是植物适应性的表现，也可能是植物细胞受损的表征[32]。

研究中，随着3种盐溶液浓度的升高，桂桑优12种子的丙二醛含量均呈上升的趋势，与闫晶秋子等[18]研究结果基本相同。试验中，3种盐溶液在0.025 mol/L浓度处理的丙二醛含量与对照组差异不显著，桂桑优12此时细胞膜系统未受损伤；在碱性混合盐、中性单盐和中性混合盐浓度分别大于等于0.1、0.15和0.2 mol/L时，桂桑优12细胞内自由基代谢平衡遭到破坏，自由基过剩引起细胞产生毒害，引发或加剧膜脂过氧化作用，细胞膜功能发生紊乱，细胞膜系统损伤，严重时甚至会导致植物细胞死亡[33]。

植物的耐盐性是一个受多种因素影响的较为复杂的综合性状[34]，桂桑优12种子对3种盐胁迫响应不同，采用单一指标很难评价其耐盐能力，脯氨酸和丙二醛含量是植物抗逆能力强弱的一项重要生理指标，选择这2个生理指标与萌发特性相关指标，采用隶属函数法对桂桑优12种子的耐盐性进行综合评价，最终获得桂桑优12种子对3种盐胁迫的抗性大小，从而真实反映桂桑优12耐盐性的强弱。研究中，3种盐溶液对桂桑优12种子萌发的胁迫，最严重为碱性混合盐(NaCl+Na2CO3)，最轻的为中性混合盐(NaCl+Na2SO4)。在碱性混合盐、中性单盐和中性混合盐的胁迫下，桂桑优12种子萌发的适宜浓度分别为0.043 1、0.040 8和0.036 4 mol/L，其耐盐极限浓度分别为0.252 4 、0.295 9 和0.290 5 mol/L；桂桑优12种子萌发阶段对这3种盐胁迫均具有一定的耐受性。在新疆盐碱地栽培桂桑优12时，应提前分析其土壤的的盐碱组成成分及含量，采用排水、洗盐并结合土壤改良剂、种植绿肥、施有机肥等相应措施，降低盐碱土的盐碱含量[13]。

4 结 论

随着3种盐溶液浓度的升高，桂桑优12种子的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数均呈下降的趋势而桂桑优12种子的游离脯氨酸、丙二醛含量均呈上升的趋势。桂桑优12种子发芽率与盐浓度间的回归关系显著。在碱性混合盐、中性单盐及中性混合盐的胁迫下，桂桑优12种子萌发的适宜浓度分别为0.043 1、0.040 8和0.036 4 mol/L，耐盐极限浓度分别为0.252 4、0.295 9和0.290 5 mol/L。碱性混合盐对桂桑优12种子萌发的胁迫最严重，中性混合盐的胁迫最轻。