黄脊竹蝗荧光定量PCR内参基因的鉴定与筛选*

方林鑫 李志红 张守科 张 威 舒金平 王浩杰

(中国林业科学研究院亚热带林业研究所 杭州 311400)

黄脊竹蝗(Ceracriskiangsu)是重要的森林害虫，危害100多种竹子，分布广、暴发频繁，常造成重大经济损失，制约我国竹产业健康发展(徐天森等，2004)。2020年，黄脊竹蝗飞跃中老边境侵入我国，引发蝗灾，损失惨重。利用黄脊竹蝗的“趋泥行为”诱杀成虫是当前防治该虫的主要手段，而明确黄脊竹蝗“趋泥行为”的发生机制是制定高效行为调控策略的关键(滕莹，2012；张守科等，2017；张威等，2018)。目前，仅在行为和生理生化层面上对竹蝗“趋泥行为”的内在机制进行了探索，要进一步揭示其分子机理，基因调控层面的解析是必要的研究内容，其中相关基因的定量表达分析至关重要，但至今尚未有黄脊竹蝗内参基因筛选和鉴定方面的报道。

反转录实时荧光定量PCR(real-time quantitative reverse transcription-PCR，RT-qPCR)具有定量准确、灵敏、通量大等优点，是验证基因特异性表达及研究基因功能的有效方法(Yanetal.，2012；Ibanezetal.，2016；Shakeeletal.，2018)。在RT-qPCR试验中，RNA浓度、cDNA转换效率、扩增效率等因素存在误差且无法避免，最终影响试验结果的准确性。为了减轻误差因素的干扰，在检测基因表达水平变化时常需要引入内参基因作为参照物(Radonietal.，2004；Huggettetal.，2005；Mughaletal.，2018)，借助样品中内参基因的稳定表达量对试验结果进行校正和标准化，以提升结果的可信度，而筛选不同试验条件下合适的内参基因是开展相关研究的关键(陈孝仁等，2012；Liangetal.，2014)。理论上，内参基因应在任何试验条件或任意部位组织细胞中均可稳定表达，并且其表达量不受任何因素影响(Kozeraetal.，2013；Jansketal.，2013)，因此内参基因一般选用传统的管家基因，如β-肌动蛋白基因(β-actin)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)、α-延伸因子基因(EF1-α)、核糖体蛋白基因(RPS、RPL)和18S核糖体RNA基因(18SrRNA)等(Sękalskaetal.，2006；史彩华等，2016)。同时，理想的内参基因不存在假基因，具有高度特异性，与目的基因也具有相似的表达量(Wanetal.，2010；Caoetal.，2012；Ferdousetal.，2015)。但研究表明，同一种内参基因常因物种、发育条件、环境胁迫等因素的差异，其表达稳定性存在显著差异，并不存在绝对稳定的万能内参基因(Yuanetal.，2014；Shakeeletal.，2018)，且内参基因的稳定表达也是相对的(Lüetal.，2018)。在开展基因定量研究时，需选择在同试验条件下稳定表达的内参基因，且通常会选用2个或以上内参基因，以保证获取更为准确的数据(史彩华等，2016；Shivhareetal.，2016；Shakeeletal.，2018)。本研究使用GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3种软件对不同龄期、成虫不同性别及不同组织黄脊竹蝗的内参基因进行筛选和稳定性分析，以期为黄脊竹蝗及直翅目其他昆虫基因定量研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫及处理

黄脊竹蝗卵采自湖南省益阳市桃江县竹蝗发生区(111°85′32″ E，28°42′89″ N)，置于温室中(26 ±4 ℃，RH70%±5%)孵化，孵化后的蝗蝻转移至2.0 m×2.0 m×2.0 m的60目大网中用2年生盆栽毛竹(Phyllostachysedulis)饲养至成虫。对孵化前3天的卵粒，孵化后不同龄若虫(1～5龄)及成虫进行随机取样，3个重复，每重复4粒卵或4头蝗虫(雌、雄各2头)。解剖成虫头部、触角、唇须、精巢、卵巢和飞行肌等器官/组织样品。所有样品用液氮速冻，并保存于 -80 ℃冰箱中供试。

1.2 试剂及主要仪器

试剂盒：RNAprep Pure Tissue Kit(天根生化科技有限公司，中国)、FastQuant RT Super Mix(天根生化科技有限公司，中国)、2 × Taq PCR MasterMix(天根生化科技有限公司，中国)、PowerUp SYBR Green Master Mix(Applied Biosystem，美国)；化合物：β-巯基乙醇(CAS：60-24-2，中国国药集团)；主要仪器：LifeECO-PCR仪(杭州博日科技有限公司，中国)、Q225 q-pcr荧光定量PCR仪(北京酷搏科技有限公司，中国)、SIGMA-3K15离心机(北京五洲东方科技发展有限公司，德国)、Q6000-Quawell超微量可见分光光度计(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，美国)。

1.3 总RNA的提取和cDNA的合成

按照试剂盒说明对不同龄若虫、成虫不同部位进行总RNA提取，利用可见分光光度计对总RNA的质量和浓度进行检测，样品OD260/OD280=1.94 ～ 2.02，凝胶电泳结果均清晰可见28S与18S条带，隐约可见5S条带。每个样品按照反转录试剂盒说明操作，对总RNA进行反转录，合成总cDNA。反转录过程采用20 μL反应体系：4 × FQ-RT Super Mix 5 μL，Total RNA 2 μL，ddH2O补充至20 μL。反转录步骤：42 ℃持续15 min(反转录反应)，95 ℃持续3 min(酶灭活过程)。总RNA于 -80 ℃低温保存，用于合成cDNA；总cDNA于 -20 ℃低温保存，用于RT-qPCR。

1.4 引物的设计和合成

基于黄脊竹蝗的二代和三代转录组测序结果，选择了9种昆虫常用的内参基因：TUB、RPS27A、RPL10、AK、GAPDH、EF1A、RPS3、Actin和18SrRNA。NCBI上检索获得9种内参基因序列(表1)，利用SeqHunter 2软件在黄脊竹蝗全长转录组数据库(本试验室构建)中比对同源序列；基于同源性最高的序列，使用NCBI在线工具Primer-BLAST(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计定量PCR特异性引物(表2)，引物长度为20～22个碱基；退火温度：18SrRNA为59 ℃，其余均为60 ℃；扩增产物长度大于90 bp、小于250 bp。引物均由浙江尚亚生物技术有限公司合成。

1.5 RT-qPCR

采用10 μL反应体系：PowerUp SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物(2 μmol·μL-1)各0.5 μL，cDNA模板0.5 μL，ddH2O补充至10 μL。qPCR采用3步标准反应模式：UDG酶激活50 ℃ 120 s；预变性95 ℃ 120 s；变性95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 60 s，共40个循环，荧光信号收集于延伸阶段。qPCR反应结束后，立即进行溶解曲线的分析，溶解曲线条件如下：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s(此过程进行荧光采集)。每样品进行3次平行技术重复，Ct值取3次结果平均值。取1龄～5龄若虫头部及雄性与雌性成虫的触角、唇须、头部、肌肉组织和精巢/卵巢共15个组织样品，每样品3个重复。

1.6 标准曲线的绘制和引物扩增效率验证

将总cDNA模板进行倍数为5的梯度稀释，即获得50、5-1、5-2、5-3、5-4ng·μL-1浓度的cDNA模板，按照1.5节流程进行qPCR。依据结果，以lg(cDNA模板浓度)为横坐标，Ct值为纵坐标，利用SPSS 20软件分析二者线性关系，估计线性方程，得到判定系数(R2)与斜率，根据公式E=(10(-1/slope)-1)× 100求得扩增效率E(Radonietal.，2004)。

1.7 数据处理及候选内参基因稳定性分析

不同组织分析时选用雄成虫头部、触角、唇须、肌肉组织和精巢，不同性别分析时分别选用雌、雄成虫头部、肌肉、精/卵巢，不同发育期分析选用1龄～5龄若虫。采用SPSS 20软件对RT-qPCR所得Ct值整体进行方差分析，利用GeNorm(Vandesompeleetal.，2002)、NormFinder(Andersenetal.，2004)和BestKeeper(Pfaffletal.，2004)软件评价9种候选内参基因在不同条件下的稳定性，进行分析与筛选。将Ct进行2-Δt转换相对表达量，在一个内参基因中，同一条件下所有样品Ct与最小Ct之差为Δt，再计算2-Δt，2-Δt用于GeNorm与NormFinder的分析。GeNorm通过计算会得出每个候选内参基因的M，M越小的内参基因稳定性越好，该软件的特点是最终挑选2个或2个以上最适内参基因，内参基因个数判定值为V。当Vn/Vn+1<0.15，n取最小值时，n即为最适内参基因个数；Vn/n + 1均大于0.15时，则以最小Vn/n + 1值时的内参基因个数作为筛选标准(马飞，2012)。NormFinder计算原理与GeNorm相似，也是通过计算获得每个内参基因稳定值，稳定值越小，代表该内参基因表达越稳定，依据其稳定值进行排序，该软件的特点是计算样品间的变异，而且只筛选出一个最合适的内参基因。BestKeeper最多只能进行10个内参基因和10个目标基因表达水平的比较，将Ct输入后，自动计算标准变异系数(SD)与差异值(P)等数据用以判定内参基因的稳定性，SD越小，该内参基因越稳定，若P大于0.05，则结果无意义，该软件的特点是可以分析目的基因的表达水平。

2 结果与分析

2.1 9种内参基因分析与Ct值比较

参照其他昆虫已公布序列(冯波等，2016；Dzakietal.，2017；Quetal.，2018)，筛选到9种候选内参基因的转录组测序结果(表1)。9种黄脊竹蝗的内参基因均首次被鉴定，与其他昆虫相应基因序列一致性均高于70%；另外，黄脊竹蝗9种候选内参基因匹配期望值(E)为0(或近为0)，表明比对基因完全匹配，这也说明了这些内参基因的高度保守性。

表1 黄脊竹蝗内参基因比对Tab.1 Comparison with hit species on reference genes of Ceracris kiangsu

2.2 引物特异性评价与扩增效率检验

9种候选内参基因不同浓度梯度cDNA模板与Ct值间存在显著的线性相关性(P<0.001，0.988 ≤R2≤ 0.998，表2)。每种内参基因RT-qPCR溶解曲线图都呈现明显单一峰，验证了引物的特异性(图1)。计算扩增效率，E均在93%～114%之间，表明RT-qPCR反应有效。

表2 候选内参基因RT-qPCR引物序列、扩增效率及判定系数Tab.2 Sequence,amplification efficiency and determination coefficient of the RT-qPCR primers for candidate reference genes

图1 不同浓度梯度9种内参基因溶解曲线Fig.1 Melting curve of nine reference genes with different concentration gradients

2.3 9种内参基因在不同样品中的表达水平

所有样品RT-qPCR结果显示，整体Ct范围为7.54～36.22之间，各内参基因Ct值组间差异显著(F=181.95，P<0.0001)。其中，EF1A基因Ct(30.08 ± 2.26)最大，显著大于除AK(28.23 ± 3.45)和GAPDH(28.76 ± 1.99)外的其他候选基因(图2)。Actin(23.55 ± 3.84)18SrRNA(10.78 ± 2.58)作为传统的内参基因，表达丰度相对较高；除18SrRNA与Actin外，各基因Ct表达丰度均在25以上(图2)。Actin的Ct波动最大，变异值达到13.98；GAPDH在各样品中表达量波动最小，变异值为6.33。除AK(5.10)和Actin(6.12)外，各基因四分位差(IQR)均小于4，样品Ct数据集中(图2)。

图2 9种候选内参基因在所有样品中的CtFig.2 Ct value of nine reference genes in all samples不同小写字母表示差异显著(P <0.05)。Different lowercase letters mean significant difference(P <0.05).

2.4 GeNorm软件分析

不同组织分析中，V4/5(0.323)的值最小，所以9种待选基因中有4种基因适合作为成虫不同组织qPCR的内参基因，依照M排序依次为RPL10、TUB、GAPDH和RPS27A(图3A)。不同性别分析与不同组织分析V的结果相似，均大于0.3，且V2/3为最小值，故RPL10与GAPDH为不同性别qPCR最适内参基因(图3B)。在不同龄若虫分析时，V3/4=0.149 <0.15，因此有3种基因适合作为不同龄若虫qPCR的内参基因，依照M排序依次为RPS3、RPL10和GAPDH(图3C)。

图3 GeNorm软件评价9种内参基因稳定性Fig.3 Stability of nine reference genes estimated by GeNorm softwareA：不同组织Different tissues；B：不同性别Different genders ；C：不同龄若虫Different instars；1:TUB;2:RPS27A;3:RPL10;4:AK;5:GAPDH;6:EF1A;7:RPS27A;8:Actin;9:18S rRNA。括号内外数字表示基因稳定值一致。The two gene in and outside the round bracket mean the same stability.

2.5 NormFinder软件分析

不同组织分析时，最稳定内参基因为GAPDH(0.320)，RPL10(0.739)次之；不同性别分析时，最稳定内参基因为GAPDH(0.318)，RPL10(0.458)次之；不同龄若虫分析时，最稳定的2种内参基因依次为RPS3(0.107)和RPL10(0.237)(表3)。

表3 NormFinder软件评价9个内参基因稳定性Tab.3 Stability of nine reference genes estimated by NormFinder software

2.6 BestKeeper软件分析

不同组织分析时，稳定性最高的内参基因为RPL10，18SrRNA次之(虽然EF1A与TUB2种基因的SD比18SrRNA小，但其P均大于0.05，稳定值无意义，不适合作为内参基因)。不同性别分析时，SD最小的2种内参基因为RPL10与GAPDH，EF1A的P大于0.05，稳定值无意义，不适合作为内参基因。不同龄若虫分析时，仅4种基因的P小于0.05，按SD由小到大依次为RPL10、RPS3、AK、Actin，可作为内参基因(表4)。

表4 BestKeeper软件评价9种内参基因稳定性Tab.4 Stability of nine reference genes estimated by BestKeeper software

3 讨论

本研究选择昆虫常用的内参基因在黄脊竹蝗不同发育阶段、不同性别及不同组织中的稳定性进行评估，筛选出了稳定值合适的基因作为不同条件下的内参基因。首次对黄脊竹蝗9种候选内参基因(TUB、RPS27A、RPL10、AK、GAPDH、EF1A、RPS3、Actin、18SrRNA)进行评价验证，发现这9种内参基因与其他昆虫相应基因序列一致性极高，匹配差异小，是较佳的内参基因候选者，同时也进一步证明了这些内参基因在昆虫进化中具备高度保守性。

内参基因的筛选通常采用专业软件对候选内参基因的稳定值进行分析，并基于各软件判定的稳定值进行综合排序以选定合适的内参基因。大量研究结果表明，多内参基因组合较单一基因更具优势，但过多的内参基因会造成试验数据冗杂，使后续的基因表达量计算更为繁琐，因此内参基因的最佳数目通常为2个(王金星等，2014；Shuetal.，2018；Wangetal.，2018)。本研究使用3个软件对不同条件下的黄脊竹蝗内参基因稳定值进行了独立分析，尽管各软件的计算原理不同，但在不同条件分析时，给出稳定性排名前2位的内参基因高度重合(图3、表3、表4)，因此2个内参基因是本研究最理想的数目，与多数学者的建议一致。

内参基因的选择因物种或发育等条件的差异而不同。不同物种之间，最合适内参基因的选择往往不同，GAPDH与UCCR可以作为斜纹夜蛾(Spodopteralitura)不同虫态的内参基因(Luetal.，2013)，而金纹细蛾(Lithocolletisringoniella)不同虫态的最适内参基因为β-TUB和β-actin(郭长宁，2014)；东亚飞蝗(Locustamigratoriamanilensis)在不同龄进行内参基因筛选时，最合适内参基因为β-actin和RP49(崔淼等，2014)。而本研究结果表明，在黄脊竹蝗不同龄若虫阶段最适内参基因组合为RPS3与RPL10(图3、表3、表4)。除物种因素外，内参基因的选择与虫态和昆虫身体组织密切相关。Zhang等(2015)研究表明棉铃虫(Helicoverpaarmigera)幼虫的不同组织中RPS15和RPL13是最为稳定的内参基因，而成虫的最合适内参基因为EF与RPL27。本研究结果表明黄脊竹蝗成虫不同组织间最稳定内参基因与若虫期最适内参基因一致，均为RPS3与RPL10。另外，性别也是影响内参基因稳定性评估的重要因素之一。冯波等(2016)发现，在松褐天牛不同性别内参基因筛选时，GAPDH与TUB是最合适的组合；对于牧草盲蝽(Lyguspratensis)，SDHA+GST的组合是不同性别成虫稳定性最高的内参基因(贾冰等，2019)；而本研究结果显示RPL10+GAPDH组合是黄脊竹蝗不同性别成虫最适合的内参基因(图3B,表3、4)。

研究表明，RPL10基因在斜纹夜蛾(Spodopteralitura)、二化螟(Chilosuppressalis)等植食性昆虫不同组织、不同种群密度饲养及不同取食条件下表达非常稳定，适合做内参基因(Luetal.，2013；徐红星等，2019)，而本研究中，GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3种软件分析表明，RPL10基因在黄脊竹蝗不同龄期若虫、雌、雄成虫及不同组织中均稳定表达(图3B，表3、4)。不同若虫龄分析时，基于GeNorm与NormFinder评价，RPS3是稳定性最高的内参基因(图2、表3，表4)。RPS3的稳定性在粉茎螟(Sesamianonagrioides)、家蚕(Bombyxmori)、步甲(Carabidae)中也得到印证，可以作为特定条件下基因表达的内参基因(杜畅，2013；Luetal.，2015；刘小强等，2018)。GAPDH是参与糖酵解反应的酶，广泛分布于各种组织中，在进化上高度保守。作为传统的持家基因，GAPDH常常被作为内参基因用于各种昆虫基因表达研究中。GAPDH在松褐天牛不同发育阶段、不同性别的化学感受组织中表达非常稳定(冯波等，2016)；美国白蛾(Hyphantriacunea)内参基因的筛选中，在不同温度处理下，最稳定的内参基因组合是EF1A和GAPDH(陶蓉等，2019)。本研究进一步证实了GAPDH基因的稳定性，GAPDH符合BestKeeper软件对内参基因稳定性的要求(表4)；同时在NormFinder软件分析不同组织与不同性别时，稳定性最高(表3)。GeNorm分析认为，GAPDH与RPL10是不同性别下基因表达研究中最合适的内参基因组合(图3)。

4 结论

本研究首次在黄脊竹蝗转录组基因中鉴定9种内参基因，并成功设计这些基因RT-qPCR特异性引物。利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper 3个软件对这9种候选内参基因的稳定性进行评价，综合参考3个软件的优势与特点，在不同组织分析时，最合适内参基因为RPL10和RPS3；在不同性别分析时，RPL10与GAPDH为稳定性最高的内参基因组合；在不同若虫龄分析时，RPS3和RPL10是最合适的内参基因。本研究为后续黄脊竹蝗功能基因验证及相对表达量研究奠定了基础。