AMF 对铁尾矿区草本植物生长参数、营养吸收及种间竞争的影响

吴 慧，陈保冬，朱永官，岳献荣，张乃明,4，夏运生,2,4

（1.云南农业大学资源与环境学院, 云南 昆明 650201；2.中国科学院生态环境研究中心, 北京 100085；3.中国科学院大学, 北京 100049；4.云南省土壤培肥与污染修复工程实验室, 云南 昆明 650201）

我国拥有丰富的矿石资源，大规模的工业采矿活动带来巨大经济利益的同时，不可避免地产生了大量矿业废弃物，其中尾矿产生量占加工矿石总量的97%～99%[1]，一般未经任何处理存放在露天矿山中，是陆地生态系统的主要污染物之一，在各类公害中排名第18 位[2]。作为世界上第二大铁尾矿生产国家，2015 年我国尾矿产量约60.7 亿t[3]。有“十里铁山”之称的大孤山铁矿是我国最大的露天铁矿，经近百年的开采加工，尾矿堆存量巨大。闲置的铁尾矿不仅占用大量土地资源，覆盖原有植被，严重影响周围土壤中的生物群落，而且对尾矿周边的土壤、水体及空气造成严重污染，对人类健康产生严重威胁[4-5]。

目前，尾矿治理中常用的修复方法有物理修复、化学修复和生物修复。植物修复是一种高效、廉价、环境友好型生物修复技术，被认为是尾矿治理的最佳方式之一[6]。铁尾矿理化性质差，生境破坏严重，是植被重建的困难立地类型之一[7]。因此，寻找一种既能增强植物定植的能力又能提高尾矿植被多样性的模式已经成为研究热点之一。铁尾矿营养匮乏，具有固氮能力的豆科植物可优先选择。豆科/禾本科混种，豆科植物对禾本科植物养分吸收和生长具有促进作用[8]。在自然条件下，丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)能与80%的植物根系建立共生关系，形成丛枝菌根结构[9]。AMF一方面能增强植物对矿质元素的吸收，促进植物生长，提高植物抗逆能力[10-11]；另一方面，在间作水平上，能调节植物间竞争作用[12]。铁尾矿因具有矿质养分含量低、物理结构差等不利因素，植物很难在尾矿砂中存活，但接种AMF 能提高植物的存活率，促进植株在复合逆境中的定植，AMF 在尾矿多样性植被恢复中的积极作用不容忽视[13-14]。

为此，采用单子叶黑麦草(Lolium perenne)和双子叶白三叶(Trifolium repens)两种先锋植物，比较单独和混合种植模式下接种摩西球囊霉(Funneliformis mosseae)对植株生长参数、矿质元素吸收及种间竞争的影响，研究丛枝菌根真菌对植物适应铁尾矿的积极贡献，探讨菌根技术在铁尾矿区多样性先锋植物重建中的作用。

1 材料与方法

1.1 培养基质

试验所用铁尾矿砂采自辽宁省鞍山市大孤山铁矿(41°02′42″～41°03′37″ N， 123°02′55″～123°04′08″ E)。尾矿砂pH 为8.26，有机质、全磷(P)及 水 溶 性P 含 量 分 别 为2.89 g·kg-1、92.7 mg·g-1和0.79 mg·kg-1，阳离子交换量为1.58 mol·kg-1，全量铁(Fe)、锰(Mn)、铜(Cu)和锌(Zn)含量分别为118 322、428、5.74 和27.9 mg·kg-1，DTPA 可提取态Fe、Mn、Cu 和Zn 含量分别为41.0、5.24、0.38 和0.30 mg·kg-1。尾矿砂过2 mm 筛，高压蒸汽120 ℃灭菌2 h，杀灭土著菌根真菌。

1.2 供试植物和菌根真菌

供试植物为白三叶和黑麦草，播种前用10%H2O2对种子进行表面消毒10 min ，蒸馏水冲洗多次后白三叶催芽一昼夜、黑麦草催芽三昼夜，出芽后播种。

供试丛枝菌根真菌摩西球囊霉在“中国丛枝菌根真菌种质资源库”编号为BGC XJ03A，由北京市农林科学院植物营养与资源研究所王幼珊研究员提供，分离自新疆阿克苏水稻根际，用高粱(Sorghum bicolor)扩繁，每10 g 菌剂摩西球囊霉为120 个孢子。

1.3 试验设置

两种植物单独种植[单种白三叶(W)、单种黑麦草(R)]或混合种植[白三叶和黑麦草混种(混合种模式下的白三叶(W/R)、混合种模式下的黑麦草(R/W )]，对不同种植模式均设置不接种(NM)和接种摩西球囊霉 (FM)共6 个处理，每个处理重复4 次。为了保证控制试验各处理水分和养分条件的统一和一致性，以内衬一个塑料袋的白色塑料花盆为种植容器，每盆装1 kg 灭菌的尾矿砂和基础养分，混匀后平衡两周。接种处理添加50 g 菌剂，对照处理添加50 g 灭菌菌剂。试验前基底内加基肥氮60 mg·kg-1，后期追施氮30 mg·kg-1，磷30 mg·kg-1，钾67 mg·kg-1，微量元素按常量施用，肥料配置成Hoagland’s 营养液添加。

该盆栽试验研究在中国科学院生态环境研究中心温室中完成，温度控制在20～25 ℃，自然采光，在植株的整个生长过程中采用称重法，保持盆栽含水量为田间持水量的60%～70%。白三叶单独种植每盆播32 颗种子，黑麦草单独种植每盆播28 颗种子，混合种植处理，白三叶播种16 颗，黑麦草播种14 颗，均匀播种于容器中。播种前一天浇水130 mL，播种白三叶时对土壤表面进行松翻，播种黑麦草时在土壤表面开沟，播入种子后，覆土浇水。牛皮纸遮盖待植物出土，出苗后单种白三叶间苗至16 株，单种黑麦草间苗至14 株；混种模式下白三叶间苗至8 株，混种模式下黑麦草间苗至7 株。

1.4 植株样品采集和测量

收获时齐地面将植株地上部剪下(混种处理分别收获)，用去离子水洗净、烘干、称重。从矿砂中清洗出根系(混种处理分别收获)，称鲜重后取约0.5 g(鲜重)用于测菌根侵染率，其余烘干称重。

植物样品烘干后剪碎称取约0.3 g 左右样品，用HNO3、HClO4混合酸消煮制备待测溶液。用电感耦合等离子发射光谱仪 (ⅠCP-OES, Optima 2000DV,Perkin Elmer Co.USA) 测定Fe、Mn、Cu、Zn、P 矿质元素的浓度。用曲利苯蓝染色-直线截获法测定菌根侵染率[15-16]。

1.5 数据处理

根冠比(root to shoot ratio, RSR) = 地下生物量/地上生物量；铁吸收效率 = 植株铁吸收量/根系生物量。

土地当量比[17](land equivalent ratio, LER) = (混种系统白三叶产量/单作系统白三叶产量) + (混种系统黑麦草产量/单作系统黑麦草产量)。LER ＞ 1，表明具有产量优势，反之有劣势。

种间相对竞争能力[18](aggressivity, A) = (混种系统黑麦草产量/单种系统黑麦草产量)－(混种系统白三叶产量/单种系统白三叶产量)。A ＞ 0 表示黑麦草竞争能力强于白三叶；A ＜ 0 表示白三叶竞争能力强于黑麦草。

采用Excel 2000 统计及做图，采用SPSS 软件对种植模式和菌根处理进行双因素方差分析，在两者交互作用显著的情况下，对所有处理进行LSD 多重比较，检验各处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 菌根侵染率和根冠比

方差分析表明(表1)，不同种植模式、不同菌根处理及二者互作极显著影响着植物根系的菌根侵染率(P＜ 0.001)；不同菌根处理和菌根与种植模式的交互作用极显著影响着植株根冠比(P＜ 0.001)，不同种植模式显著影响植株根冠比(P＜ 0.05)。

表1 不同种植模式和菌根处理下菌根侵染率和根冠比Table 1 Mycorrhizal infection rate and root-shoot ratio under different planting modes and mycorrhizal treatments

对照(NM)植株根系未观察到AMF 侵染现象。接种FM，无论单独种植还是混合种植，白三叶根系均具有较高的菌根侵染率，在45%左右；黑麦草单独种植或混合种植的根系菌根侵染率都较低，在22%左右。FM 处理显著降低了白三叶根冠比(P＜ 0.05)；混合种植显著增加了黑麦草根冠比。

2.2 植物生长状况

方差分析表明，不同种植模式和不同菌根处理间的交互作用极显著影响白三叶和黑麦草地上部干重(P＜ 0.001)，不同菌根处理显著影响黑麦草单种地上部干重(P＜ 0.01)；不同种植模式极显著影响植物地下部干重(P＜ 0.001)，二者交互作用显著影响植物地下部干重(P＜ 0.05)。

白三叶生物量混合种植处理下低于单独种植，而黑麦草趋势与之相反(图1)。单独种植或混合种植情况下，接种FM 均显著提高白三叶的地上部和根系生物量(P＜ 0.05)，促进其生长，接种 FM 显著降低混种模式下黑麦草地上部生物量，对黑麦草地下部生物量影响不明显，混合种植显著增加了黑麦草生物量。接种FM 显著降低了混种模式下白三叶生物量。混合种植NM 处理下白三叶生物量最低。

图1 不同种植模式和接种处理下单株植物地上部和根系生物量干重Figure 1 Dry weight of shoot and root of each plant under different plant mode and mycorrhizal treatments

2.3 植株铁含量

方差分析表明，不同植物种植模式、不同菌根处理及其二者交互作用均极显著影响植株地上部及根系铁含量(P＜ 0.001)。

综合来说(图2)，黑麦草混合种植处理植株体内铁含量在各处理中最高，接种FM 显著 降低除单种黑麦草外植物地上部铁含量(P＜ 0.05)，白三叶混种FM 处理降低最明显，降低了55.2%。单种模式下，接种FM 对两种植物根系铁含量没有显著影响；混合种植模式下，FM 处理显著增加白三叶根系铁含量(P＜ 0.05)，增加了71.3%，而对黑麦草影响趋势相反。

图2 不同种植模式和接种处理下植物地上部和根系铁含量Figure 2 Iron concentration in plant shoot and root under different plant mode and mycorrhizal treatments

2.4 植株铁吸收量

方差分析表明，不同种植模式以及种植模式和菌根处理的交互作用极显著影响植物地上部铁吸收量(P＜ 0.001)，不同菌根处理显著影响地上部铁吸收量(P＜ 0.05)；不同种植模式、不同菌根处理以及二者交互作用均极显著影响根系铁吸收量(P＜ 0.001)。

黑麦草单独种植或混合种植，每株对铁的吸收量远高于单独种植白三叶(P＜ 0.05)。 接种FM 显著降低了混种模式下黑麦草对铁的吸收量 (P＜ 0.05)，降低了 44.3%～45.51%，增加了白三叶和单种模式下黑麦草铁吸收量。较单种，混种显著增加了黑麦草铁吸收量，但对白三叶没有明显影响(图3)。

图3 不同种植模式和接种处理下单株植物地上部和根系铁吸收量Figure 3 Iron uptake by plant shoots and roots under different plant mode and mycorrhizal treatments

2.5 根系铁吸收效率

方差分析显示，不同种植模式以及种植模式与菌根处理交互作用极显著影响植物根系铁吸收效率(P＜ 0.001)，不同菌根处理显著影响植物根系铁吸收效率(P＜ 0.05)。

混合种植情况下，白三叶和黑麦草对铁的吸收效率均显著增加(P＜ 0.05) (图4)。单独种植条件下，接种FM 与未接种之间差异不显著(P＞ 0.05)，混合种植情况下，接种FM 能显著增加白三叶对铁的吸收效率(P＜ 0.05)，增加了63.5%，显著降低黑麦草对铁的吸收效率(P＜ 0.05)，降低了42.5%。

图4 不同种植模式和接种处理下植物根系的铁吸收效率Figure 4 Iron uptake efficiency of plant roots under different plant mode and mycorrhizal treatments

2.6 植株磷、锌、铜、锰含量

方差分析表明(表2)，植株磷、锰含量在不同种植模式、不同菌根处理内差异极显著(P＜ 0.001)，且两者具有极显著交互作用(P＜ 0.001)；铜含量在不同种植模式和不同菌根处理间的交互作用极显著(P＜ 0.001)；锌含量在不同菌根处理和不同种植模式间的交互作用显著(P＜ 0.05)，不同种植模式内差异极显著(P＜ 0.001)。

总的来说，白三叶锌含量除NM-单种处理外均显著高于黑麦草(P＜ 0.05)。无论单独或混合种植，NM 处理下白三叶磷含量显著低于黑麦草，接种后反而显著高于黑麦草。接种FM 显著增加了白三叶磷和铜含量，磷含量增加168%～357%，显著降低了单种黑麦草铜、锌含量。接种FM 显著降低了两种植株体内的锰含量(表2)。

表2 不同种植模式和菌根处理下植株矿质元素含量Table 2 P, Zn, Cu, and Mn concentrations in plants under different plant mode and mycorrhizal treatments

2.7 根际pH 变化

方差分析显示，不同菌根处理以及菌根与种植模式的交互作用极显著影响根际pH (P＜ 0.001)，不同种植模式对根际pH 无显著影响(P＜ 0.05)。

单独种植黑麦草NM 处理的铁尾矿砂pH 低于其他处理，接种FM 对基质pH 影响明显。单种模式下，接种FM 显著降低了白三叶根际的pH (P＜0.05)，显著增加了黑麦草根际pH (P＜ 0.05)。混种模式下，接种FM 显著增加了黑麦草根际的pH (P＜0.05) (表3)。

表3 收获时不同种植模式和菌根处理下铁尾矿砂pHTable 3 pH of iron mine tailings from different plant mode and mycorrhizal treatments at harvest

2.8 植物生产力和种间竞争能力

与未接种相比，接种处理降低了白三叶与黑麦草混种模式的当量比，减少了约20.8%，并减弱了两种植物的种间竞争能力。混种模式下，当量比都大于1 (表4)。种间竞争能力结果是相对于白三叶而言，无论接种与否，种间竞争能力都大于0，接种处理使黑麦草竞争能力呈下降趋势，提高了白三叶的竞争能力。

表4 白三叶和黑麦草混种系统的当量比和竞争能力Table 4 Aggressivity of mixed planting system of white clover and ryegrass

3 讨论

3.1 AMF 及种植模式对白三叶和黑麦草矿质营养和生长的影响

AMF 能通过改善植物对矿质营养元素的吸收增强植物对逆境的适应能力，在菌根共生系统中，植物为菌根真菌提供光合产物，而菌根真菌通过其庞大的根外菌丝网络促进植物对水分和矿物质营养物质的吸收(主要为磷、锌等元素)[19-20]。Segnitz 等[21]研究指出，丛枝菌根真菌侵染植株根系能够显著提高植物对土壤中营养物质的吸收及生长。肖毅雪等[22]试验表明，在铜尾矿中，单独种植或混合种植条件下，接种菌根真菌均能显著提高白三叶对磷的吸收，促进白三叶的生长。本研究结果与其一致(图1、表2)。铁尾矿中，无论单独种植还是与黑麦草混合种植，接种FM 显著促进白三叶对磷、铜等矿质元素的吸收，显著增加白三叶的干重，促进白三叶生长。

豆科/禾本科混种，豆科植物生物固氮能够促进禾本科植物生长。有研究指出，蚕豆(Vicia faba)进入玉米(Zea mays)根区的根系很少，但玉米根系能进入蚕豆根区，吸收更多的养分，促进自身生长[23]。张德等[8]发现，柱花草(Stybsanthes guianensis) || 扭黄茅(Heteropogon contortus) || 孔颖草(Bothriochloa pertusa)间作体系的土地当量比均大于1，具有间种优势。本研究结果得出混种系统土地当量比大于1，白三叶与黑麦草混种具间作优势。

种植白三叶显著降低了铁尾矿砂pH，有利于活化矿质元素，但同时可能增加金属元素的富集，影响植物生长。菌根真菌在一定程度上可以减少重金属对植物的毒害。Tang 等[24]研究表明，在低浓度重金属胁迫下，接种菌根真菌并不抑制寄主植物对重金属的吸收，而是将重金属输送到植物根际，使其被大型菌丝吸收到植物的根和地上部中，通过促进宿主植物对营养物质的吸收和运输，促进植物生长，稀释重金属浓度来减轻重金属对宿主植物的毒害。Liu 等[25]指出，菌根真菌能通过促进植物光合作用和营养元素吸收，增加植物生物量，从而稀释植物中重金属的浓度，降低重金属的毒性。本研究中，单独种植或混合种植模式下接种FM，白三叶对铁元素的吸收均呈增加趋势，FM 处理显著增加白三叶生物量，显著降低白三叶铁含量；黑麦草单独种植，FM 处理显著增加黑麦草对铁的累积量，但混合种植情况下却显著降低了铁的吸收量；接种菌根真菌，白三叶地上部铁含量显著降低，根部铁含量显著增加。

3.2 AMF 对种间竞争的影响

大量研究证实，AMF 不但能改善植株个体本身营养状况[26]，且能改善种间竞争关系[27]。赵乾旭等[28]研究指出，玉米 || 大豆间作系统中，玉米相对大豆一直表现出竞争优势，接种菌根真菌，调整了营养分配，改善了两者间的竞争。张宇亭等[29]指出，接种能提高菌根植物的竞争能力，提高竞争优势，这对土地资源利用与植被多样性具有十分重要的意义。本研究结果显示，相对于白三叶，黑麦草竞争能力大于0，表现出竞争优势，但接种处理白三叶菌根侵染率显著高于黑麦草，使黑麦草竞争优势降低而提高白三叶的竞争能力。

可见，接种丛植菌根真菌对黑麦草生长和元素吸收影响没有白三叶明显，可能与黑麦草本身抗逆性强、对菌根真菌的依赖性低有关。该研究中更有价值的结果是两种植物混合种植情况下接种菌根真菌能提高白三叶的竞争力，这对于强化铁尾矿上草本先锋植物的生长有非常重要的意义。

4 结论

通过在铁尾矿砂上种植白三叶和黑麦草并接种丛枝菌根真菌，结果表明，白三叶对菌根真菌的依赖性更强。接种丛枝菌根真菌能显著提高白三叶对磷的吸收并促进植物生长。混合种植则显著促进了黑麦草生长。菌根真菌在白三叶与黑麦草的种间竞争中，对增强白三叶竞争能力有积极作用。利用丛枝菌根真菌与白三叶、黑麦草的多样性共生关系对强化铁尾矿的生态恢复具有良好的应用前景。