NaCl 胁迫对亚柄薹草形态和相关生理指标的影响

李英博，韩戴宇，付如裕，鞠志新

（1.吉林农业大学园艺学院, 吉林 长春130000；2.吉林农业科技学院农学院, 吉林 吉林 132000）

土壤盐渍化威胁农作物的生长和产量，阻碍现代农业的可持续发展，是一个全球性的生态问题。全世界超过1/3 的灌溉土地受到盐碱化的影响[1]。此外，不良的灌溉实践和土地清理导致土壤次生盐碱化，从而限制了土地利用和作物产量[2]。因此，了解植物对盐胁迫的形态、生理、代谢和生化反应，对于培育耐盐植物具有极其重要的意义。盐分对植物的形态和生理功能造成了负面影响。盐分会抑制种子萌发、植物生长、发育和产量。在盐胁迫下，植物表现出鲜重(fresh weigt, FW)和干重(dry weight, DW)下降，尤其是地上部分，株高和冠幅的下降，主要是由于叶片数量减少或形成的叶片越来越小[3]。在高盐浓度下，植物活性氧(reactive oxygen species, ROS)积累引起氧化应激，此时活性氧清除机制激活，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)等抗氧化系统的增强提高了植物的耐盐性[4]。随着胁迫时间的延长，抗氧化酶系统的作用减弱，ROS 不断增多，膜脂过氧化作用增强，丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量增加[5]。由于盐分在植物体内大量积累，破坏了细胞膜透性，导致电导率上升；与此同时脯氨酸、可溶性糖等渗透调节物质含量增加，清除自由基，减少植物受到的盐害[6-7]。植物中的叶绿素含量与植物的健康直接相关。盐胁迫下叶绿素浓度降低是一种常见现象，但是也会出现叶绿素浓度增加的现象，这可能是由于受到胁迫的植物叶片中每单位叶面积的叶绿体数量增加所致[8-9]。

亚柄薹草(Carex subpediformis)是莎草科薹草属的多年生草本植物，主要分布于我国东北、华北、西北等地区[10]。亚柄薹草植株较矮，适应性强，并具返青早、生长期长、根茎发达、耐践踏等优点[11]。目前国内外对亚柄薹草的研究，主要在植物资源与物种多样性以及草本植物引种、抗旱性评价等方面[12-14]，对其耐盐性的研究鲜见报道。为了探讨能否将亚柄薹草引种栽培至盐渍环境下，并研究其耐盐机制和耐受程度，本研究以亚柄薹草为研究材料，分析不同浓度NaCl 胁迫对其生长、生理相关指标的影响，计算其耐盐阈值，以期为亚柄薹草耐盐机制的深入研究提供数据支持，并为今后亚柄薹草野生资源开发与利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试亚柄薹草材料引种于吉林省白山市靖宇县，现栽培保存于吉林省吉林市吉林农业科技学院九站校区园艺场长白山薹草资源圃。

1.2 试验设计

试验于2021 年5 月中旬至7 月中旬在吉林农业科技学院园艺场进行。于5 月中旬选择生长健壮且长势一致的亚柄薹草，栽植在底部带有托盘的花盆中，栽培基质为复合基质(园土 ∶ 草炭 ∶ 沙子 = 1 ∶ 1 ∶ 1)，在防雨水条件下进行栽培，每盆栽3 丛，每丛20 芽株。培养1 个月后，将所有材料修剪至相同高度，进行NaCl 胁迫处理。NaCl 胁迫处理共设5 个浓度，0 (CK)、50、100、200、300 mmol·L-1，其中对照组0 (CK)为蒸馏水处理。随机区组排列，每个浓度处理设3 个重复，每1 盆作为一个重复，共15 盆。为减小盐分冲击，50 mmol·L-1以上NaCl 浓度采用分次浇灌，首次浇灌50 mmol·L-1NaCl 浓度，之后每天递增50 mmol·L-1浓度，达到预设终浓度后，再处理14 d。每隔2 d 用最终浓度的NaCl 溶液浇灌，其余时间采用喷湿叶面补充水分。为保持NaCl 浓度恒定，每盆浇灌同等体积NaCl 溶液，随时将流入托盘的盐溶液再次浇入花盆中，反复几次，直至不再流出，以使盆土盐分不会流失。在盐胁迫处理14 d后，测量植株生长指标，并对植株叶片进行随机取样，用蒸馏水清洗叶片表面的尘土，擦干，立即进行液氮速冻，放入超低温冰箱贮藏，用以测定植物生理指标。

1.3 指标测定及方法

1.3.1 生长指标测定

测量亚柄薹草从地面到草丛顶部的垂直高度，记为株高；测量亚柄薹草南北和东西方向的平均值记为冠幅。剪取每盆亚柄薹草单株地上部，用蒸馏水冲洗干净，并用滤纸迅速吸干表面水分，然后放入105 ℃烘箱中杀青20 min，80 ℃烘干至恒重，称重记为干重。

1.3.2 生理指标测定

细胞膜透性采用电导率法测定，MDA 含量采用硫代巴比妥酸法测定，SOD 活性采用氮蓝四唑光还原法测定，POD 活性采用愈创木酚法，游离脯氨酸含量采用磺基水杨酸提取法测定，可溶性糖含量采用蒽酮法测定，叶绿素含量采用丙酮-乙醇提取法测定[15]。

1.3.3 耐盐阈值计算

多数植物以其植株生物量下降50%时的盐浓度作为该植物的耐盐阈值[16-17]。该试验以NaCl 盐处理14 d 后亚柄薹草株高、冠幅、干重为因变量(y)，以NaCl 浓度为自变量(x)建立回归方程，最终以因变量比对照处理下降50%时所对应的最低盐浓度作为亚柄薹草的耐受阈值。

1.4 数据分析

采用SPSS 22.0 软件进行多元回归分析及单因素方差分析，采用Duncan 法进行多重比较，显著性水平设定为0.05，数据结果用平均值 ± 标准差表示；采用Excel 2016 进行图表的制作。

2 结果与分析

2.1 NaCl 胁迫对亚柄薹草生长的影响

亚柄薹草的株高、冠幅、干重均随着NaCl 浓度的增加呈下降趋势，但各自的变化不同(表1)。当NaCl 浓度为50 mmol·L-1时，盐胁迫对亚柄薹草株高的影响不显著(P＞ 0.05)，当NaCl 浓度大于50 mmol·L-1时亚柄薹草株高显著降低(P＜ 0.05)。当NaCl 浓度为300 mmol·L-1时，亚柄薹草株高较对照降幅最大，为63.72%。低浓度盐胁迫对亚柄薹草冠幅的影响较小，当NaCl 浓度为300 mmol·L-1时显著抑制了亚柄薹草冠幅的生长，较对照下降了55.10%。各胁迫浓度处理下的干重与对照存在显著差异(P＜0.05)，干重在盐胁迫浓度达到200、300 mmol·L-1时降幅最大，较对照分别下降了44.57%和55.22%。

表1 NaCl 胁迫对亚柄薹草生长指标的影响Table 1 Effects of NaCl stress on growth index of Carex subpediformis

2.2 NaCl 胁迫对亚柄薹草叶片质膜透性和丙二醛含量的影响

亚柄薹草叶片相对电导率随着盐浓度的增加均呈现逐渐升高的趋势(图1)，各处理之间差异显著(P＜ 0.05)。当胁迫浓度增加到200 和300 mmol·L-1时，亚柄薹草叶片的相对电导率分别为53.17%和62.73%，比对照提高了20.80 和30.37 百分点。亚柄薹草丙二醛含量随着盐浓度增加呈逐渐上升趋势(图1)。当含盐量在50～300 mmol·L-1时，MDA 含量均与对照差异显著(P＜ 0.05)；但当盐浓度为200～300 mmol·L-1时差异不显著(P＞ 0.05)。

图1 NaCl 胁迫对亚柄薹草叶片质膜透性和丙二醛含量的影响Figure 1 Effects of NaCl stress on leaf membrane permeability and malondialdehyde (MDA) content of Carex subpediformis

2.3 NaCl 胁迫对亚柄薹草叶片抗氧化酶活性的影响

在盐胁迫处理下，亚柄薹草叶片SOD 活性和POD 活性均呈现先升高后降低的趋势，且峰值均出现在100 mmol·L-1，分别较对照提高了221.09%和224.42%，说明100 mmol·L-1NaCl 可能是亚柄薹草的最佳耐受盐度(图2)。各处理间SOD 活性都存在显著差异(P＜ 0.05)，POD 活性在50 mmol·L-1时，与对照相比差异不显著(P＞ 0.05)，仅比对照升高了2.52%。当NaCl 浓度超过100 mmol·L-1时，SOD 和POD 活性均有明显的降低，说明此时亚柄薹草受到盐害加重，自身防御系统被破坏，从而两种抗氧化酶活性降低。

图2 NaCl 胁迫对亚柄薹草叶片超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性的影响Figure 2 Effects of NaCl stress on leaf SOD and POD activity of Carex subpediformis

2.4 NaCl 胁迫对亚柄薹草叶片游离脯氨酸和可溶性糖含量的影响

亚柄薹草叶片的游离脯氨酸含量随NaCl 浓度增加，呈先增后减的趋势，各浓度胁迫处理均与对照形成显著差异(P＜ 0.05)，当NaCl 浓度为100 mmol·L-1时其含量急剧上升且达到峰值，为对照的5.02 倍；当胁迫浓度超过100 mmol·L-1时，游离脯氨酸含量降低(表2)。

亚柄薹草叶片中可溶性糖含量变化与游离脯氨酸变化趋势相似，但有所不同。在低盐浓度下(50 mmol·L-1)与 对 照 相 比 差 异 不 显 著(P＞ 0.05)；在100 mmol·L-1时上升幅度最大，较对照增加了73.85% (表2)。说明亚柄薹草可以通过增加可溶性糖来适应盐胁迫，但随着NaCl 浓度增加，超过可受胁迫程度，不能正常生长，可溶性糖含量降低。

表2 NaCl 胁迫对亚柄薹草叶片游离脯氨酸和可溶性糖含量的影响Table 2 Effects of NaCl stress on leaf proline and soluble sugar content of Carex subpediformis

2.5 NaCl 胁迫对亚柄薹草叶片叶绿素含量的影响

随着NaCl 胁迫浓度的升高，亚柄薹草叶片叶绿素含量先上升后下降(表3)。随着盐浓度的增大，亚柄薹草叶绿素a 在NaCl 浓度为100 mmol·L-1时相比对照达到峰值，为1.92 mg·g-1，并与其他处理之间差异显著(P＜ 0.05)，且随着土壤含盐量的升高，叶绿素a 含量显著降低。亚柄薹草叶绿素b 与叶绿素a变化趋势相近，但各处理均与对照差异显著。亚柄薹草叶绿素a + b 在胁迫浓度为300 mmol·L-1时显著低于对照，降幅为33.01%。NaCl 处理对亚柄薹草叶绿素a/b 影响较小，各处理之间差异不显著(P＞ 0.05)，在盐浓度为50 mmol·L-1时达到最大，为1.63 mg·g-1。

表3 NaCl 胁迫对亚柄薹草叶片叶绿素含量的影响Table 3 Effects of NaCl stress on leaf chlorophyll content of Carex subpediformis

2.6 NaCl 胁迫下亚柄薹草耐盐阈值的确定

为进一步研究亚柄薹草对不同浓度NaCl 胁迫的耐盐程度，分别以株高、冠幅、干重3 个指标为因变量(y)，以NaCl 浓度为自变量(x)进行回归分析，建立回归方程(图3)。可以看出，株高、冠幅、干重与盐浓度之间二次曲线模型的R2值均高于线性模型R2值，F统计量的显著值都等于0.00，远远小于0.01，说明两个模型都显著，并且都具备常数项，因此二次曲线函数关系拟合效果最优。从3 个回归方程可知，以干重作为因变量求出的耐盐阈值最小(169 mmol·L-1)，说明以干重生物量下降50%的盐浓度作为亚柄薹草耐盐阈值更符合实际。因此，可初步认为亚柄薹草在NaCl 的胁迫下耐盐阈值为169 mmol·L-1。

图3 NaCl 浓度与株高、冠幅和干重的曲线拟合Figure 3 Curve-fitting of NaCl concentration and plant height, crown width, and dry weight

3 讨论与结论

灌溉水中的高盐浓度会导致植物生长减少，限制叶片扩展，并改变地上部分和根系之间的关系[18]。本研究通过分析不同浓度NaCl 胁迫下亚柄薹草株高、冠幅、和干重的变化发现，随着盐浓度的升高其形态特征表现呈下降趋势，说明盐分通过渗透作用和毒性作用降低植物生长，通过根系的运动降低水力传导率，从而减少水分，使植物失水严重，干重随之下降。低浓度盐胁迫对亚柄薹草形态特征的影响较小，说明亚柄薹草对低盐浓度具有一定的适应性，随着盐浓度的增加亚柄薹草的生长受到明显的抑制。该结果与大穗结缕草(Zoysia macrostachya)[19]在盐胁迫下水分吸收与运输能力受限，从而引起叶片水分下降，使植物受害的研究结果类似。但也有研究表明，低浓度的盐胁迫对植物生长起促进作用，但与本研究不符，这是因为不同植物间耐盐性不同[20]。

细胞膜在维持植物细胞的稳定和正常新陈代谢活动上发挥着关键作用[21]。本研究中，盐浓度增大使亚柄薹草叶片相对电导率逐渐升高，对植物的伤害加剧，细胞膜受害程度加重，电解质外渗率上升，使得亚柄薹草生长受到抑制。有研究表明植物在逆境条件下常常发生膜脂过氧化并产生MDA，MDA的含量可以反映质膜受到的伤害程度[22]。本研究中亚柄薹草MDA 含量随着盐浓度增加呈逐渐上升趋势，表明亚柄薹草体内膜脂过氧化受损，而细胞膜脂的损伤，导致细胞内可溶性物质外渗，破坏了细胞内酶及代谢作用区域，细胞代谢紊乱，使植株出现毒害症状，最终抑制亚柄薹草的生长。该结论与杨佳鑫等[23]在梅花(Prunus mume)和山桃(Prunus davidiana)耐盐生理特性研究中盐胁迫对其丙二醛含量影响的结论一致。

盐分会限制植物中CO2的固定，产生氧化应激，这是由活性氧(ROS)[如超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)和羟基]的过度产生和积累介导的[24]，这种反应会导致膜脂过氧化、酶抑制和核酸损伤破坏细胞代谢症状的出现。为了应对活性氧，植物实施了包括酶和非酶抗氧化机制的复杂防御系统[25]。SOD 和POD 作为抗氧化酶可以有效地清除自由基，保护酶系统，并控制膜脂过氧化，维持机体新陈代谢平衡，从而使植物减轻逆境伤害[26]。在盐胁迫处理下，亚柄薹草叶片SOD 活性和POD 活性均呈现先升高后降低的趋势，且峰值均出现在100 mmol·L-1，表明亚柄薹草在轻度盐胁迫下体内抗氧化酶系统活性增强，清除了过多的氧自由基，从而保持活性氧产生与清除之间的平衡，使其免受伤害；但 在 盐 浓 度 为200～300 mmol·L-1时SOD 和POD 活性下降说明在中高盐胁迫下体内代谢紊乱，超过了亚柄薹草自身保护能力，打破了保护酶系统清除能力，使植物受到严重的伤害。该结果与3 种李属(Prunus)彩叶植物[27]在盐胁迫下通过抗氧化酶活性增强来清除过多的自由基，且抗氧化酶活性的变化可以反映植物在盐胁迫下的受害程度的研究结果一致。

暴露于盐胁迫下的植物的常见反应有渗透调节增加、细胞壁弹性变化、饱和干重比降低和水质外体百分比增加等。有毒离子和相容溶质的积累和区隔以增加渗透耐受性是植物耐盐性的机制之一[28]。气孔开放的渗透调节过程是通过溶质的运动发生的，这些溶质被称为渗透压细胞，影响细胞间的水分运动[29]。在有机渗透压细胞中，脯氨酸(Pro)是最重要和最有效的相容溶质[30]。除了作为渗透保护剂外，据报道，Pro 还具有抗氧化特性，它可以作为分子伴侣在脱水过程中保护生物大分子的结构，从而赋予植物对环境胁迫的耐受性[31]。在本研究中，亚柄薹草叶片游离脯氨酸含量随NaCl 浓度的增加呈先增后减的趋势，且当NaCl 浓度大于50 mmol·L-1时脯氨酸大量积累且与对照形成显著差异，说明随着盐浓度的增加，游离脯氨酸通过迅速积累来调节植物受到的渗透胁迫，保持细胞渗透平衡，减缓植物受到的伤害。叶片可溶性糖含量，随NaCl 浓度增加，呈先升后降的趋势。糖在盐胁迫下的渗透保护、渗透调节、碳储存和自由基清除中起着核心作用，Ruan[32]报道，盐胁迫下可溶性糖的增加可能与蔗糖磷酸合酶活性和淀粉磷酸化酶活性降低有关。可溶性糖含量在低盐浓度下(50 mmol·L-1)与对照相比变化较小，说明在低盐浓度下渗透胁迫作用的影响还比较小，然而随着盐浓度的升高，可溶性糖含量降低，说明可溶性糖可以减缓因渗透胁迫对植物造成的伤害，但是超过其承受范围，合成就会受到抑制，含量下降。本研究结论与北美豆梨(Pyrus calleryana)[33]通过积累渗透调节物质来缓解渗透胁迫对植物造成伤害的研究结果一致。

植物在光合作用过程中，叶绿素对光能的吸收、传递与转化起着至关重要的作用，其含量的变化会受到环境中盐害的影响[34-35]。植物在盐碱条件下，叶绿素含量会有所下降，但在本研究中，低盐条件下(50～100 mmol·L-1)叶绿素含量逐渐积累，这可能是由于受到胁迫的植物叶片中每单位叶面积的叶绿体数量增加所致[8]；在盐浓度超过200 mmol·L-1时叶绿素含量下降，说明高盐分加速了亚柄薹草叶绿素的降解，使更多的叶绿素遭到破坏[36]。

多年来，许多研究将耐盐性阈值视为提高植物耐盐性的具体目标。植物耐盐性通常通过绘制相对产量作为根区盐度的连续函数来表示，或者，盐积累到地上部的动态过程。这两种关系通常由两个相交的线性区域表示，这两个区域确定了：1)一个特征阈值，在此阈值之后产量开始下降；2)一个特定的斜率，它定义了盐度增加时产量的下降[37-38]。综上，虽然NaCl 胁迫下亚柄薹草的生长受到了不同程度的抑制，但以植物的株高、冠幅、干重等指标建立回归方程，可以计算出亚柄薹草的耐盐阈值[39]。本研究计算发现，以干重生物量下降50%求出的耐盐阈值浓度最小，可以作为亚柄薹草耐盐阈值的确定指标，因此初步确定了亚柄薹草的耐盐阈值为169 mmol·L-1，说明亚柄薹草对盐胁迫具有一定的耐受性，为今后亚柄薹草耐盐机制的深入研究提供数据支持，并为亚柄薹草野生资源开发与利用提供理论参考。