双活性中心抗肿瘤仲钨酸-B化合物的合成及体外药理活性研究

曲小姝，石 丹，赵 娜，于晓洋，杨艳艳，刘 岩

(吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022)

多金属氧酸盐(Polyoxometalates，POMs)，简称多酸，是由高价态的前过渡金属通过氧原子桥连结合而成的金属氧簇[1].几十年来，随着世界各国对多酸药理活性和结构修饰的研究不断深入，多酸药物化学蓬勃发展，其中最引人注目的是多酸抗肿瘤药物的研究.多酸抗癌谱广、抗肿瘤活性强、化合物本身毒性低，在抗肿瘤药物领域有极高应用价值[2-5].仲钨酸盐-B是一种经典的同多酸，结构式为[H2W12O42]10-，其具有良好的抗艾滋病毒活性[6-8].我们报道了一种新型仲钨酸盐-B化合物[Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O，研究发现，经过过渡金属Cu修饰后的仲钨酸盐药理活性显著增强[9-10]，这说明化合物中Cu和W12簇为双活性抗肿瘤中心.文献记载很多金属配合物具有生物活性，如过渡金属锌配合物在抗肿瘤研究方面受到广泛关注[11-13].本文采用常规水溶液合成方法，以仲钨酸盐-B为基本建筑单元，利用过渡金属锌作为连接子，构筑基于仲钨酸盐-B的双活性中心新化合物 (H3O)6[Zn(H2O)6]6{Zn6(C5H11NO)6(H2O)6[H2W12O42]3}·4H2O (简写为ZnW12)，选择HeLa、HepG2、SHY5Y、SKOV-3 4种肿瘤细胞对其体外抗肿瘤活性进行了研究.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：Bruker Smart CCD Apex(Ⅱ)型单晶衍射仪；AlpHa Centaurt FT/IR型红外光谱分析仪；美国TA Q600同步热分析仪；日本Olympus倒置相差显微镜；BIORAD公司680型酶标仪.

试剂：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐 (MTT) 购自美国sigma公司；胎牛血清(Fetal bovine Serum)、RPMI 1640 (pH在7.0～7.2之间)、胰蛋白酶(trypsin)均购自Gibco公司；双抗(青霉素钠、硫酸链霉素)购自西安制药公司；其他化学试剂均为分析纯.HeLa、HepG2、SHY5Y和SKOV-3细胞株为吉林医药学院科学实验室保存并提供.

1.2 化合物的制备

称取Na2WO4·2H2O (2.30 g，6.96 mmol) 溶于100 mL水中，用稀H2SO4调pH值至4.16.称取Zn(NO3)2·6H2O (2.56 g，8.61 mmol) 溶于50 mL水中，将钨酸钠溶液与硝酸锌溶液缓慢混合，用甲基吗啉溶液 (酸化到pH等于4.22) 和HOAc-NaAc溶液 (pH为 4.36) 调节pH至3.4左右，常温搅拌20 min，冷却至室温，静置，20 d后出现无色块状晶体.

1.3 X-射线单晶衍射测试

选取大小为0.279×0.181×0.183 mm3的单晶，采用Mo-Kα(λ=0.071 073 nm)为辐射源，室温296 K下，用Bruker Smart CCD Apex(Ⅱ)衍射仪，扫描范围1.65°<θ<25°.应用经验吸收校正.共收集29 071个衍射数据(独立衍射点6 916，Rint=0.054 6[I>2σ(I)，hkl值范围：-29≤h≤30，-30≤k≤19，-37≤l≤36].晶体结构用直接法解出，对全部非氢原子及其各向异性热参数进行全矩阵最小二乘法修正，氢原子坐标采用理论加氢方法得到，最终偏离因子R1=0.028 0，wR2=0.072 3[I>2σ(I)；R1=0.035 3，wR2=0.074 8 (all data).结构分析表明，该晶体属于三方晶系，空间群R-3m：H，a=2.443 48 (7) nm，b=2.443 48 (7) nm，c=3.045 86 (19) nm，α=90 (3)°，β=90 (3)°，γ=120 (2)°，V=15.749 2 (13) nm3，Z=3.结构简式为C30H66N6O190W42Zn6，相对分子质量为11 664.81.所有计算均使用SHELXTL-2018/3 (Sheldrick，2018) 程序完成.

1.4 MTT法测肿瘤细胞活力

把对数生长期的HeLa、SKOV-3、HepG2和SHY5Y细胞调成密度为1×105个/mL，在96孔培养板中每孔加入200 μL密度为1×105个/mL的肿瘤细胞悬液，在37 ℃、5% CO2条件下培养，24 h后把肿瘤细胞分成空白对照组及6组实验组(浓度为0.1，1，10，20，50及100 μmol/L的药物)，用DMEM培养基稀释液分别培养24 h.培养结束，每孔加入新鲜配制的MTT溶液20 μL并再孵育4 h，当在倒置显微镜下看到孔板内的细胞周围出现丝状紫色结晶体时倒掉上清液，每孔加DMSO150 μL振荡溶解细胞并用平板摇床摇匀，在波长570 nm使用酶标仪测定光密度值(OD).按以下公式计算增殖抑制率：增殖抑制率=[1-药物试验组吸光度值/对照组吸光度值]×100%.重复试验 3次，取平均值.

1.5 细胞凋亡的形态学观察

取对数生长期的HeLa、SKOV-3、HepG2和SHY5Y细胞，培养24 h后，去上清液，将细胞分成正常对照组以及浓度为0.1，1，10，20，50及100 μmol/L的ZnW121—6组，4种肿瘤细胞用DMEM培养基稀释液培养24 h后，与正常对照组一起于倒置显微镜下观察不同浓度药物对肿瘤细胞的影响，从生长抑制、细胞形态角度进行评估.

2 结果与讨论

2.1 晶体结构

X-射线晶体学研究表明，ZnW12中仲钨酸盐阴离子[H2W12O42]10-通过Zn八面体连接成了二维结构，游离态的配阳离子[Zn(H2O)6]2+和结晶水存在于晶格之间.如图1所示，在[H2W12O42]10-阴离子中，W—O键可分为3种类型：(1)端氧W—O(t)键长范围为0.171 3(10)～0.242 7(7) nm；(2)桥氧W—O(μ)键长范围为0.176 8(7)～0.215 7(6) nm；(3)键连到3个钨原子上的桥氧W—O键长范围为0.228 1(9)～0.222 8(6) nm.化合物中Zn原子呈6配位八面体构型，分别和4个来自[H2W12O42]10-的O，1个配位水上的O以及1个甲基吗啉分子上的O配位.如图2所示，从c轴方向看，3个W12簇通过Zn八面体连接而成一个三角形的小环，小环之间又通过Zn八面体的连接以及W12簇的共用连接形成了二维层结构.二维层结构中含有由12个W—O八面体连接而成的大环，形成了圆形的孔洞，其间容纳着6个椅式构象的甲基吗啉分子.值得一提的是，结构中还存在另一种Zn2+原子，与6个配位水配位形成了八面体构型，孤立存在于钨簇构成的二维层间.二维层之间是孤立的，在三维空间错位排列，从c轴方向观察化合物具有孔洞，其间容纳着游离水.

图1 Zn修饰的[H2W12O42]10-阴离子球棍图

绿色：钨氧八面体；紫色：锌氧八面体

2.2 红外光谱

图3 ZnW12的红外光谱

2.3 热重分析

合成化合物的热重分析如图4所示，在TG曲线中，化合物共有3步连续失重：47 ℃～118 ℃，118 ℃～148 ℃和148 ℃～447 ℃，分别对应于结晶水、配位水和有机物甲基吗啉的失去.达到665 ℃后，多酸骨架开始坍塌，最后炙灼残渣为W和Zn的氧化物.实际失重量为15.44%，与理论计算值15.07%基本一致，说明热重分析与晶体结构表征吻合.

图4 ZnW12的TG曲线

2.4 MTT法测肿瘤细胞活力

采用MTT法评估了ZnW12对HeLa、SKOV-3、HepG2和SHY5Y肿瘤细胞株增殖的影响(见表1).与对照组比较，不同浓度的ZnW12对肿瘤细胞的抑制率增大，表明ZnW12对4种肿瘤细胞均有抑制作用，且随着浓度的增加细胞的存活率下降，具有药物剂量依赖性，与母体酸Na10(H2W12O42)·26H2O (简写为NaW12) 相比[10]，经过渡金属锌修饰的仲钨酸盐抗肿瘤活性显著增强.

表1 不同浓度NaW12和ZnW12处理肿瘤细胞的抑制率和IC50

2.5 细胞凋亡的形态学观察

分别用浓度1，10，20，50及100 μmol/L的ZnW12处理肿瘤24 h后，观察细胞形态.图5显示正常对照组的肿瘤细胞紧贴瓶底，细胞密集，细胞间连接紧密，呈有规则的多边形，细胞触角较短，圆形细胞较少.ZnW12处理后，细胞较为稀疏，附壁疏松，脱壁，细胞变圆变亮.

a—d：对照组；e：50 μmol/L ZnW12处理的HeLa；f：20 μmol/L ZnW12处理的SKOV-3；g：50 μmol/L ZnW12处理的HepG2；h：20 μmol/L ZnW12处理的SHY5Y

3 结论

本文基于分子设计的思想，利用常规水溶液合成方法，合成了一种由过渡金属锌修饰的新型仲钨酸盐.通过X-射线单晶衍射、红外光谱和热重分析对化合物结构进行了表征，同时对其体外抗肿瘤性质进行了初步研究.MTT细胞活性检测说明，ZnW12对HeLa、SKOV-3、HepG2和SHY5Y肿瘤细胞增殖均有抑制作用，IC50远远小于未经锌修饰的母体多酸，这表明过渡金属锌修饰的仲钨酸盐具有双活性抗肿瘤中心，药理活性显著增强.