黄芩生物技术研究进展

陈秀清，汪文华，何恩铭

（1.扬州工业职业技术学院 化工学院，江苏 扬州 225127；2.福建省亚热带植物研究所／福建省亚热带植物生理生化重点实验室，福建 厦门 361006）

黄芩作为中药，主要利用唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）的干燥根。在春季或秋季采挖，除去须根和泥沙，晒后撞去粗皮，晒干。黄芩味苦性寒，具有清热燥湿、泻火解毒、凉血止血、除热安胎功能[1]。黄芩中含有多种生理活性成分，主要有黄酮类化合物、甾醇、氨基酸、生物碱和微量元素等[2]。其中最主要的4 种成分为黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和汉黄芩苷[3]。近年来，随着对其活性成分黄芩苷及黄芩素研究的不断深入，发现这些化合物具有抗癌、护肝、抗病毒等多种药理作用[4-6]，黄芩及其两种活性成分黄芩苷和黄芩素还可以预防新陈代谢综合症[7]，因此，开发和利用黄芩及其活性成分作为药物的研究不断增加[8]。且国家也不断出台相关文件促进中医药传承创新发展。传承精华、守正创新，利用生物技术保护黄芩野生资源，提高黄芩生产效率，能够满足市场需求及实现可持续发展，具有广阔前景。

1 黄芩组织培养

组织培养技术在人工种子制备、植株快速繁殖、无毒幼苗培养及次级代谢产物富集等方面取得了较好的成效，黄芩组织培养研究也不断深入。

1.1 黄芩人工种子

目前黄芩已经成为常用中药，为大宗中药材，其需求量不断增大，野生的黄芩资源根本不能满足市场需求，必须依靠人工种植。因此，对黄芩规范化种植、高产优质种植、机械化、无害化栽培生产研究不断深入[9,10]。葛人杰等主要依据黄芩种子发芽率和种子活力，参考种子千粒质量、形态大小、含水量、饱满度等，制定了的黄芩种子质量三级分类标准[11]，为黄芩种子的质量评价和黄芩人工栽培提供参考和指导。俄罗斯专利（RU2415928C1）中将黄芩的根中部切成厚度为2～3 mm 横切片，这些切片段被包封封装在一个含海藻酸盐无激素的涂层，涂层为加入claforan 抗生素的Gamborg 营养成分，claforan 的浓度为300～550 mg/L，制成人工种子，见图1。采用该方法培养，一年半内无细菌感染迹象，与储存的黄芩根相比，具有较高的生长活性和原黄酮浓度[11]。

图1 黄芩人工种子Fig.1 Artificial seeds of Scutellaria baicalensis

1.2 黄芩快速繁殖

李博凤等尝试黄芩幼茎、幼叶和叶柄3种外植体，以幼茎（茎段）为佳，在MS＋0.5 mg/LBA＋0.5 mg/L NAA 培养基上进行愈伤组织诱导和再生芽分化培养。然后再在1/2MS+0.1 mg/L IBA 进行生根培养，黄芩根及须根生长均较多，且颜色与形态都正常，同时生根率达到70.3%，待再生苗的根长度长到2 cm 左右时，即可进行炼苗处理，再生苗见图2，可为黄芩种苗培养和育种提供参考[13]。

图2 黄芩再生苗Fig.2 Regenerated seedlings of Scutellaria baicalensis

吴思婧等采用组织培养法和枝条扦插法对缙云黄芩进行诱导和繁殖[14]。组织培养通过对缙云黄芩茎段外植体进行化学消毒,在MS＋2.0 mg/L6-BA+0.2 mg/LIAA 培养基上进行黄芩不定芽诱导。50 mg/LIAA 能较好地刺激不定芽生根，其生根率能达到75.0%。这样通过组织培养和扦插可以实现快速繁殖，图3为缙云黄芩插穗生根情况，再将缙云黄芩扦插苗移栽到原来的发现地，观察30～90 d，存活率达到100%，为缙云黄芩资源保护奠定了基础。

图3 插穗生根情况Fig.3 Rooting of cuttings

张静等以狭叶黄芩的茎段为外植体，用0.1%的HgCl2消毒5min，诱导腋芽培养基为MS+1mg/L 6-BA+1mg/L NAA，诱导率可达73.66%，诱导愈伤最佳培养基为MS+1 mg/L 6-BA+1mg/L 2,4-D，诱导率为91.33%；愈伤组织分化的最佳培养基为MS+1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，分化率为44.71%。芽增殖的最佳培养基同愈伤组织分化培养基，其芽增殖倍数为5.85；最佳生根培养基为1/2MS+0.2 mg/LIBA，生根率可达到74.07%；试管苗移栽到3号基质时，存活率达到79.24%，同时3号基质配方中园土占60%，远高于20%蛭石或珍珠岩，成本较低，植株健壮生长旺盛，见图4。建立的狭叶黄芩再生体系，可为狭叶黄芩野生资源在妥善保护的基础上进行开发应用提供一定的理论支持[15]。

图4 组培苗移栽Fig.4 Transplanting of tissue culture seedlings

2 黄芩细胞培养

2.1 愈伤组织诱导培养

通过培养愈伤组织获得植物次级代谢产物，具有不受自然条件影响、培养时间短、次级代谢产物含量高、效率高等优点。侯云亮选取继代培养长势良好的黄芩愈伤组织，在不添加聚乙二醇-6000 的MS 培养基中培养30～35 d，愈伤组织达到稳定生长期，根据生物生长量确定25℃为愈伤组织培养的最佳培养温度。通过高效液相色谱法测定愈伤组织中黄芩苷含量，发现其在25℃下培养，愈伤组织细胞中黄芩苷积累最多，黄芩苷积累温度和最佳愈伤组织培养温度一致。水分也影响黄芩细胞次级代谢产物的合成，聚乙二醇是常见的渗透剂，用聚乙二醇模拟土壤控水效果。在培养基中添加高浓度聚乙二醇，愈伤组织细胞合成黄芩苷会受到抑制，浓度越高其抑制作用越明显。但是愈伤组织培养到第15 d 时，抑制效果会开始减弱，黄芩苷含量增高，具体表现为：对照组＞5%＞10%＞20%＞15%，黄芩苷积累量与含量表现不同为：对照组＞20%＞5%＞10%＞15%。根据研究表现，确定黄芩愈伤组织培养积累黄芩苷控制温度控制在25℃，培养基不添加聚乙二醇[16]。

2.2 细胞悬浮培养

利用黄芩细胞悬浮培养技术可获得富含黄芩苷活性成分的黄芩细胞。韩淑兰首先用黄芩种子种植黄芩苗2 个月，得到黄芩的盆栽实生苗。然后将黄芩径段外植体培养在添加1.5 mg/L6-BA 和0.5 mg/LNAA 的MS 培养基上诱导出黄芩愈伤组织。最后对黄芩愈伤组织进行传代培养，培养三代后，获得质地疏松的黄芩愈伤组织细胞。研究表明黄芩主要次级代谢产物黄芩苷在悬浮培养20 d 时获得了最高的产量，达到78.31 mg/g。在培养基中添加一定量的诱导子，可诱导产生更高含量的黄芩次级代谢产物黄芩苷，研究发现，在培养基中添加150 umol/L 茉莉酸甲酯，悬浮培养达72 h，不但能促进黄芩细胞的生长，而且能够诱导黄芩悬浮培养细胞产生更高含量的黄芩苷。黄芩细胞的生长率与对照组相比，提高了67%，黄芩苷含量达184.62 mg/L[17]。

3 黄芩毛状根培养

通过发根农杆菌等诱导黄芩外植体产生黄芩毛状根，毛状根能够在不添加植物生长调节剂的MS 培养基上快速生长，并产生黄芩次级代谢产物。张东向等通过单因素试验确定黄芩状根培养最适的培养时间范围为15～25 d，最适的培养温度范围为26℃～28℃，最适宜的转速为110～130 r/min，最适的宜接种量为0.3～0.5 g，然后用响应面法对黄芩毛状根培养时间、温度、摇床转速和接种量相互影响进行分析并进行验证试验，发现在培养时间25d、温度27.4℃、摇床转速123 r/min、接种量0.5 g 条件下，黄芩毛状根鲜质量在（9.2±0.2）g，为黄芩毛状根的进一步培养富集黄芩苷提供一定的依据[18]。王淑芳等培养粘毛黄芩毛状根，获取黄酮类化合物。培养条件为：30 g/L 蔗糖、pH5.8 的1/2MS 培养基最适合毛状根生长，但总黄酮合成最高则在pH6.4，外源植物生长调节剂赤霉素可促进粘毛黄芩毛状根生长及黄酮类化合物生物合成，毛状根干质量达到（1.188 9±0.112 8）g/摇瓶，总黄酮含量为（37.048 6±1.776 1）mg/摇瓶[19]。

施春阳设计改制了10 L鼓泡式培养器，通气量在20～40 L/h，溶氧可维持在20%～50%，在改良的MS培养基上进行三级发酵培养，在黄芩毛状根发酵的第20 d 时，对其进行补料，补料添加1/5的生产培养基（Ⅱ），分阶段控制通气量，再发酵培养30 d，黄芩毛状根的生物量达到10.21 g/L，毛状根中黄芩苷含量达到12.3%。然后利用LX-22大孔吸附树脂提取黄芩毛状根中黄芩苷，其动态吸附量达113 mg/g，黄芩苷回收率超过82%。动态吸附分离得到的黄芩苷含量为85.6%，再将其经硅胶G色谱柱层析纯化，黄芩苷的纯度能够达到98%[20]。

郭双双利用发根农杆菌诱导黄芩产生毛状根，研究不同条件下黄芩毛状根中黄芩苷，发现随着培养温度的升高，黄芩苷含量逐渐增加，在黑暗条件下有利于黄芩毛状根中黄芩素的积累，光照条件下有利于黄芩毛状根中黄芩苷的积累。除了不断优化黄芩毛状根培养条件，提高毛状根中次级代谢产物含量的同时，采用基因工程手段，先提取黄芩毛状根中的RNA，再利用RT-PCR 技术克隆葡萄糖醛酸水解酶基因，克隆的葡萄糖醛酸水解酶基因在毛状根中表达出葡萄糖醛酸水解酶，其将黄芩苷水解成黄芩素，降低了次级代谢产物黄芩苷对毛状根生长的抑制作用，毛状根中黄芩苷含量与葡萄糖醛酸水解酶的酶活性和基因表达量呈反比例关系[21]。

Solov'Eva 等研究了黄芩内源性β-葡萄糖醛酸酶活性与体外培养分化的关系。通过研究比较在固体和液体培养基上生长的分化和未分化体外培养物中黄芩主要黄酮的含量与内源性b-葡萄糖醛酸酶（sGUS）活性之间的关系，结果表明sGUS 活性与培养物生物量的增加无关，但取决于组织分化。在液体和固体培养基上培养的毛状根比未分化培养的毛状根高10倍。在培养周期中，苷元形式在总黄酮含量中所占的份额取决于生长条件，在琼脂培养基上显著高于液体培养基，sGUS 活性与总苷元含量以及黄芩素含量之间的相关性仅在液体中生长的毛状根中观察到[22]。

4 黄芩内生真菌培养

内生真菌是一种真菌，其能生活在正常植物组织内部，但不会引起植物病害，与植物一同生长代谢，同时可产生与共生植物组织相同的次级代谢产物。这样通过单独培养内生真菌，能够从培养液中分离纯化出植物活性成分。李青连等用含氯霉素的PDA 培养基（0.4～0.5）g/L 从野生黄芩的根、茎、叶分离纯化出黄芩内生真菌，采用冷、热、光和水处理诱导内生真菌产生孢子，对其进行鉴定，黄芩生长成熟阶段产生较多种类的内生真菌。用枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、深红酵母等14种微生物作为指示菌，对内生真菌进行抗菌活性试验，发现95.8%的菌株对一种或多种指示菌具有抑菌作用，即可以从黄芩内生真菌中筛选具有抗菌成分的药物，并对其代谢产物进行进一步研究[23]。

魏希颖等[24]用PDA 固体培养基，并加入青霉素50 mg/L，链霉素50 mg/L，从药用植物黄芩根、茎、叶和花中分离得到17 株内生真菌，分离到的内生真菌中12 株至少对一种指示菌（蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等）有抑菌活性。将分离得到的内生真菌在马铃薯葡萄糖肉汤培养基进行发酵，对发酵液和菌丝体分别进行黄苷提取，首先采用薄层色谱法定性分析发酵液或菌丝体是否含有黄芩苷，经初检发现菌株J1 和H3 的液体发酵菌丝提取物中含有黄芩苷或其类似物，该菌丝提取物的Rf值和黄芩苷标准品的一样，发酵培养黄芩内生真菌可以获得黄芩苷或其类似物。但是采用高效液相色谱法对提取物进行黄芩苷含量定量检测，内生真菌菌丝提取物中黄芩苷或其类似物含量偏低，大规模工业化生产成本较高。目前通过内生真菌培养富集获取黄芩苷或其类似物仍然处于研究阶段，需要进一步优化内生真菌培养条件和构建基因工程菌，为内生真菌工业化发酵富集黄芩苷或其类似物奠定基础。

5 结语

黄芩生物技术的利用一方面可以改善黄芩品质、提高黄芩栽培效率，另一方面可以直接利用黄芩细胞或内生真菌，改善黄芩细胞或内生真菌发酵条件，以期富集高浓度的黄芩苷或其类似物。黄芩细胞培养选择不同种类的植物激素，并配制不同比例及浓度的植物激素，诱导培养出黄芩愈伤组织，进一步进行黄芩幼苗分化或直接进行细胞悬浮培养。采用转基因方法可以避免使用植物生长调节剂，如直接进行黄芩毛状根培养以期获得黄芩活性成分。采用内生真菌培养获取活性成分更能缩短培养周期，提高生产效率。在此基础上利用基因工程手段进行代谢调控，能够促进代谢产物的积累。