Exo-miRNA在慢性心力衰竭患者中的表达及其临床意义

蔡新勇 邵靓 刘员员 叶文兵 王桂根 王洪 赖珩莉 洪浪

摘要：目的 探讨外泌体微小RNA（Exo-miRNA）在慢性心力衰竭（CHF）中的表达;方法 选取CHF患者95例（CHF组）和健康自愿者90例（对照组），采集外周血液，提取外泌体中miRNA，采用PCR法测定Exo-miRNA表达情况。结果 相较于对照组，CHF组Exo-miR-126、LVEF降低，Exo-miR-210、LVESD、LVEDD增高，P<0.001;随着NYHA分级增加，血清Exo-miRNA-126、LVEF逐渐减小，P<0.05;血清Exo-miR126与LVEF呈正相关，与LVESD、 LVEDD、Exo-miR210呈负相关，P<0.05;而血清Exo-miR210与LVEF呈负相关，而与LVESD、 LVEDD呈正相关，P<0.05;血清Exo-miR-126、Exo-miR-210联合检测诊断CHF的敏感度、特异度为80.25%、91.34%;结论 CHF患者血清Exo-miR-126表达下调，而Exo-miR-210表达增强，二者表达水平与CHF的心功能密切相关。

关键词：外泌体;慢性心力衰竭;心功能;miR-126;miR-210

【中图分类号】 R541.6 【文献标识码】 A      【文章编号】2107-2306（2022）05--03

Abstract：Objective To investigate the expression of exosomal microRNA （Exo-miRNA） in chronic heart failure （CHF）;Methods 95 CHF patients （CHF group） and 90 healthy volunteers （control group） were selected， peripheral blood was collected， miRNA in exosomes was extracted， and the expression of Exo-miRNA was determined by PCR method.Results Compared with the control group， the CHF group had decreased Exo-miR-126 and LVEF， and increased Exo-miR-210， LVESD and LVEDD， P<0.001; with the increase of NYHA grade， serum Exo-miRNA-126 and LVEF gradually decreased ， P<0.05; serum Exo-miR126 was positively correlated with LVEF， and negatively correlated with LVESD， LVEDD， Exo-miR210， P<0.05; while serum Exo-miR210 was negatively correlated with LVEF， and positively correlated with LVESD， LVEDD， P <0.05; the sensitivity and specificity of combined detection of serum Exo-miR-126 and Exo-miR-210 in the diagnosis of CHF were 80.25% and 91.34%;Conclusion The expression of Exo-miR-126 in serum of CHF patients is down-regulated， while the expression of Exo-miR-210 is enhanced， and the expression levels of the two are closely related to the cardiac function of CHF.

Key words： exosomes; chronic heart failure; cardiac function; miR-126; miR-210

慢性心力衰竭（CHF）是各种心脏疾病发展的终末阶段，目前全球范围内CHF的死亡率居高不下，再住院率逐年增加，其发生、发展及预后引起了学者的高度关注，成为临床研究热点。近年来学者发现基因表达调控在CHF的发病机制发挥着重要作用，并有研究指出[1]，外泌体微小RNA（Exo-miRNA）参与了心肌纤维化、心肌细凋亡、心肌重塑等多个CHF基本病理过程，其中外泌体miR-126和miR-210的作用尤为突出，二者具有促进血管新生和介导心脏祖细胞对低氧应激的抵抗力增强的作用[2，3]，并对心血管事件风险具有良好的预测价值[4]。但目前外周血外泌体miR-126、miR-210与CHF的相关研究鲜见报道。本研究拟探讨CHF患者外周血外泌体中miR-126、miR-210表达情况，并分析其与CHF发病的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020年3月～2021年12月本院心內科收治的慢性心力衰竭（CHF）患者95例（CHF组），其中男52例，女43例，年龄46～75（61.20±8.75）岁，病程6个月～5年，平均（3.85±1.04）年，美国纽约心脏协会（NYHA）分级Ⅰ级25例，Ⅱ级27例，Ⅲ级22例，Ⅳ级21例。纳入标准：符合《中国心力衰竭诊断和治疗指南2018》[5]中CHF诊断标准;NYHA心功能分级为I～IV级;同意参与本项研究并签署知情同意书。排除标准：肝、肾功能严重损害;合并先天性心脏病、心肌梗死、心脏瓣膜病变等心脏疾病;有恶性肿瘤、自身免疫性疾病及心脏手术史者;有精神异常及依从性差者。同期选取本院健康体检自愿者（心电图检查正常，且无心血管疾病）90例为对照组，其中男49例，女性41例，年龄45～78（59.73±8.41）岁。CHF组与对照组受试者的性别（x2=0.002，P=0.968）、年龄（t=1.171，P=0.243）比较，差异无统计学意义，具可比性。本研究通过医院伦理委员会审批，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

（1）外周血Exo-miRNA表达水平测定：①样本采集与预处理：使用EDTA-K2 抗凝管采集CHF患者入院时及对照组人群晨起空腹静脉血5mL，离心处理（离心半径10cm，离心速度：3000r/min，时间：5min），分离血浆，-70℃保存待测。②血浆外泌体分离与裂解：取样本解冻后，取500uL加入Exo Quick试剂（美国 SBI公司）120uL，振荡充分混匀，4℃下放置3h;再10000r/min离心3min，移液枪吸取上清液弃去，下层即为外泌体颗粒;然后滴加350uL裂解缓冲液，涡流震荡30s，4℃静置10min，使其完全溶解。③外泌体RNA提取与纯化：向上述外泌体液加入200ul无水乙醇，混匀，按miRcute miR亲和柱（日本TIANGENS公司）试剂说明书提取、纯化外泌体总RNA，并应有Nanodrop检测总RNA质

量与浓度;③ Exo-miRNA检测：将上述纯化的Exo-miRNA+20uL无菌双蒸水溶解+12?LmiRNA反转录试剂（日本Takara公司），按反转录程序（45℃ 1h，95℃ 5min）进行逆转录，并设计引物（金斯瑞公司合成，具体序列见表1）进行PCR扩增，PCR扩增程序为预变性95℃ 5 min，变性95℃20 s，退火60℃20 s，共40个循环。扩增结束使用荧光定量PCR仪（美国Bio-RAD公司）测定miRNA相对表达量，以2-△△ct表示。

（2）心脏超声检测：使用HI VISION Ascendus勒超声仪（日立公司）对受试对象行超声心动图检查，探头频率为2. 5 MHz，测定左心室射血分数（LVEF）、左室收缩末期内径 （ LVESD）、 左室舒张末期内径（LVEDD） 等指标。

1.3 统计学方法 采用 SPSS 20.00 软件进行统计分析，计量资料（x±s）以独立样本t检验或方差分析，计数资料用x2检验，使用Pearson法分析Exo-miRNA表达与心功能参数的相关性，并绘制ROC曲线分析Exo-miRNA对CHF发生的预测价值，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清Exo-miRNA表达及心功能参数比较 见表2，CHF组Exo-miR-126、LVEF低于对照组，而Exo-miR-210、LVESD、LVEDD明显高于对照组，差异均有统计学意义，P<0.001。

2.2 不同NYHA分级CHF患者血清Exo-miRNA表达及心功能参数比较 见表3，不同NYHA分级CHF患者血清Exo-miRNA-126、Exo-miRNA-210水平及心功能参数差异均有统计学意义，P<0.05;且随着NYHA分级增加，血清Exo-miRNA-126、LVEF逐渐减小，而LVESD、 LVEDD逐渐增大，差异均有统计学意义，P<0.05。

2.3 CHF患者血清Exo-miRNA表达与心功能参数的关系 见表4，血清Exo-miR126与LVEF呈显著正相关，而与LVESD、 LVEDD呈负相关，P<0.05;血清Exo-miR210与LVEF呈负相关，而与LVESD、 LVEDD呈正相关，P<0.05;血清Exo-miR126与Exo-miR210呈负相关，P<0.05。

2.4 血清Exo-miRNA表达对CHF发生的诊断效能 血清Exo-miR-126、Exo-miR-210预测CHF发生的ROC曲线结果，血清Exo-miR-126最佳截断值取25.34时诊断CHF的AUC为0.905（95%CI：0.826～0.913，P<0.001），Exo-miR-210最佳截断值取27.12时诊断CHF的AUC为0.848（95%CI：0.712～0.853，P<0.05），二者联合检测诊断CHF的AUC为0.953（95%CI：0.759～0.916，P<0.001），敏感度和特异度依次为80.25%、91.34%，见表5。

3 讨论

CHF可导致心排出量下降、心室充血，继而导致组织血供不足和循环淤血，对心脏造成不可逆损害[6]。调查发现[7]，我国CHF患病率为1.3%，患病人数约1370万人，5年内死亡率达50%。早期发现并评估病情严重程度对改善CHF患者预后具有重要意义。外泌体是细胞间信息交流的工具，也是miRNA的重要载体，由于外泌体内miRNA因被双层膜状结构包裹，相较于血清miRNA，其具有更好的稳定性、更高的灵敏度和特异性[8-9];这也使得外泌体miRNA成为CHF早期诊断的潜在生物标志物。

心肌细胞间进行信息交流期间，细胞会富集特异性miRNA，并包装进外泌体，然后释放至细胞间隙，参与心脏的心脏病理生理学变化[10]。miR-126在调控血管新生和血管内皮损伤修复方面均发挥重要作用，与心血管疾病的发病密切相关[11]。研究发现[12]，CHF患者外周血中miR-126表达较健康人群显著下调，但将miR-126转染入CHF患者体内后，其心脏功能能迅速改善。而miR-210是缺氧调控的重要基因，其在缺氧生理状态下明显升高[13];并有学者发现miR-210在心肌细胞凋亡与增殖、心肌细胞再生及缺血心肌组织血管新生等方面的调控中均发挥着重要的作用[14-15]。可见，miR-126、miR-210在心脏疾病发病中的重要作用，本研究通过测定血清外泌体miRNA发现，CHF组Exo-miR-126、LVEF低于对照组，而Exo-miR-210、LVESD、LVEDD明显高于对照组，表明CHF患者血清外泌体miR-126、miR-210表达异常，与类似研究报道结果相符[16-17]，由此推測miR-126、miR-210参与了CHF的发生。CHF发病后心脏负荷增加、心肌缺血缺氧损伤，继而导致心室重构，LVESD、LVEDD 增大，LVEF减小，心功能逐渐变差[18]，同时缺氧环境会刺激miR-210增加，而内皮细胞分泌miR-126则受到抑制，由此导致了CHF外泌体miR-210、miR-126表达异常。此外，本研究进一步分析发现，不同NYHA分级CHF患者血清Exo-miRNA-126、Exo-miRNA-210水平及心功能参数存在显著差异，且随着NYHA分级增加，血清Exo-miRNA-126、LVEF逐渐减小，而LVESD、 LVEDD逐渐增大;相关性分析结果显示，血清Exo-miR126与LVEF呈显著正相关，而与LVESD、 LVEDD呈负相关;而血清Exo-miR210与心功能参数的关系与Exo-miR126正好相反，Exo-miR126与Exo-miR210呈显著负相关，这提示外泌体miR126、miR210参与调控了CHF的疾病进展，可作为CHF病情判断的参考指标，与研究报道结果相符[19-20]。

另外，本研究结果显示，Exo-miR-126、Exo-miR-210诊断CHF发生的特异度和灵敏度依次为73.10%和 88.51%、70.92%和89.24%，二者联合检测的特异度和灵敏度可提升至80.25%、91.34%，提示Exo-miR-126、Exo-miR-210在CHF的临床诊断中具有较高的特异度和敏感性，二者联合检测可提升CHF的诊断效能，为CHF的早期临床治疗提供参考。

综上所述，CHF患者血清Exo-miR-126表达下调，而Exo-miR-210表达增强，二者表达水平与CHF的心功能密切相关，可作为CHF临床早期诊断的潜在生物标志物。

参考文献：

[1]施冰，李晓冉，李俊峡.心力衰竭患者血浆外泌体microRNA检测及其功能分析[J].中国循证心血管医学杂志，2019，11（3）：309-311.

[2]Ong SG，Lee WH，Huang M，et al. Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease：role of exosomal microRNA transfer[J]. Circulation，2014，130（11 suppl 1）：S60-S69.

[3]谈红，李艳敏，张红明，等. 慢性充血性心力衰竭患者血浆miR-423-5p和miR-210-3p的表达变化[J]. 临床心血管病杂志，2014，30（12）：1081-1085.

[4]高玉伟，杨洪娟，胡秀红，等.miR-126水平与慢性肾脏病患者病情及心血管事件风险的相关性[J].中国临床医生杂志，2021，49（7）：810-814.

[5]中华医学会心血管病学分会心力衰竭学组， 中国医师协会心力衰竭专业委员会， 中华心血管病杂志编辑委员会. 中国心力衰竭诊断和治疗指南2018 [J] . 中华心血管病杂志，2018，46 （10）： 760-789.

[6]霍灵恩，张明剑，张银鸽，等.美托洛尔缓释片、螺内酯片及盐酸贝那普利片联合治疗慢性心力衰竭的临床研究[J].罕少疾病杂志，2022，29（02）：49-51.

[7]Guang Hao， et al. Prevalence of heart failure and left ventricular dysfunction in China： the China Hypertension Survey， 2012–2015. Eur J Heart Fail， 2019， 21（11）： 1329-1337.

[8]Jiang W ，  Wang M . New insights into the immunomodulatory role of exosomes in cardiovascular disease[J]. Reviews in Cardiovascular Medicine， 2019， 20（3）：153-160.

[9]Zamani P ，  Fereydouni N ，  Butler A E ， et al. The therapeutic and diagnostic role of exosomes in cardiovascular diseases[J]. Trends in Cardiovascular Medicine， 2018， 29（6）：313-323.

[10]曹春.慢性心力衰竭患者血漿外泌体miR-214-3p和miR-184的表达及意义[J].河北医药，2021，43（2）：246-249.

[11]郭丽， 邱卫强. 血清内分泌指标，MRI在脑垂体瘤诊断中的应用[J]. 中国CT和MRI杂志， 2020， 18（5）：4.

[12]Chen J ，  Chemaly E ，  Liang L ， et al. Effects of CXCR4 Gene Transfer on Cardiac Function After Ischemia-Reperfusion Injury[J]. American Journal of Pathology， 2010， 176（4）：1705-1715.

[13][1] Guan Y ，  X  Song，  Sun W ， et al. Effect of Hypoxia-Induced MicroRNA-210 Expression on Cardiovascular Disease and the Underlying Mechanism[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity， 2019， 2019（10159）：1-12

[14]L Zhong， J Jia， G Ye. Rian/miR-210-3p/Nfkb1 Feedback Loop Promotes Hypoxia-Induced Cell Apoptosis in Myocardial Infarction Through Deactivating the PI3K/Akt Signaling Pathway[J]. Journal of Cardiovascular Pharmacology， 2020，76（2）：207-215.

[15]张云，刘咏梅，陈恒文，等.miR-210参与心肌缺血损伤修复机制及中药调控靶点分析[J].中国中西医结合杂志，2020，40（01）：125-128.

[16]卢凯，王香云，余红.冠心病患者血清外泌体中miR-210的表达水平及其与预后的关系[J].心电与循环，2021，40（02）：145-148.

[17]李娅琳.冠心病病人外周血miR-126与sVCAM-1的表达及其相关性研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2020，18（03）：470-473.

[18]李飞， 杜战卫. CT增强扫描造影剂肾病的危险因素及水化干预效果观察[J]. 中国CT和MRI杂志， 2018， 16（8）：4.

[19]NOMAN M Z，JANJI B，BERCHEM G，et al .MiR-210 and hypoxic microvesicles：two critical components of hypoxia involved in the regulation of killer cells function[J].Cancer Letters，2016，380（1）：257-262.

[20]杨光，夏汝杰，何杨，张伟，施勇，王岚.血清微小RNA-132和微小RNA-155在心力衰竭患者中的表达及其与心肌重构的相关性[J].中华老年心脑血管病杂志，2021，23（10）：1019-1022.

第一作者：蔡新勇，男、硕士;副主任医师、江西省人民医院心内科，江西省南昌市丰和北大道266号，cxyandcxy@163.com，研究方向：冠心病、缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化

通讯作者：邵靓，男、博士;副主任医师、江西省人民医院心内科，江西省南昌市丰和北大道266号，E-mail： shaoliang021224@hotmail.com 研究方向：心衰、心肌病、肿瘤心脏病学

基金项目：江西省卫生计生委科技计划课题项目合同号202130031