一测多评法比较不同生产厂家复方丹参片中丹参酮类成分的含量

高 奇王海燕周 伟吕宝兴李玉琴

1.山东第一医科大学（山东省医学科学院）药学院，山东泰安 271016；2.泰安市食品药品检验检测研究院，山东泰安 271099

复方丹参片由丹参、三七和冰片三种中药成分构成，具有疏通血脉、祛除瘀血、顺气止痛的功效，在冠心病、胸闷及心前区刺痛等疾病的治疗中发挥着重要的作用［1］。丹参作为该方君药，其有效物质包括脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹酚酸类活性成分，这些物质均具有活血化瘀、改善心脏功能等作用［2］，2020版《中国药典》（一部）复方丹参片质量标准项下以丹参酮ⅡA 为指标控制其丹参酮类成分的含量。丹参中的二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA 等丹参酮类成分受品种、产地、栽培、采收和加工等因素的影响，研究表明陕西、山东、四川等产地的丹参中丹参酮类成分的含量高于安徽、河北、湖北等产地［3-4］。2020版《中国药典》（一部）中复方丹参片质量标准项下规定，丹参以乙醇为溶剂回流提取、浓缩后，与三七粉、冰片粉及辅料混匀后制得［5］，而丹参的提取时间和温度、真空度等生产工艺对丹参酮类成分影响较大。调查研究显示，全国有700多家企业生产复方丹参片，但不同厂家之间复方丹参片的有效成分含量差异较大［6-8］。因此，本实验以丹参酮ⅡA为内参物，采用一测多评法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）测定了10个不同生成厂家复方丹参片中二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA成分的含量，以便了解不同厂家4 种丹参酮类成分含量的差异。

1 仪器与材料

1.1 仪器

230Ⅱ型高效液相色谱仪（大连依利特分析仪器有限公司）；LC-20AT 型高效液相色谱仪及LC-2030 型高效液相色谱仪（日本岛津）；KQ-250DB 型数控超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；SHIMUADZU AUW220D 型高精度电子天平（日本岛津）。

1.2 色谱柱

Thermo ODS-2 HYPERSIL、ICHROM C18、Agilent ZORBAX SB-C18规格均为4.6 mm×250 mm，5µm。

1.3 试剂和药品

二氢丹参酮Ⅰ（批号180109，含量＞98%），隐丹参酮（批号171024，含量＞98%），丹参酮Ⅰ（批号170926，含量＞98%），丹参酮ⅡA（批号171106，含量＞98%）对照品购自上海融禾医药科技有限公司；甲醇（天津市凯通化学试剂有限公司）；复方丹参片均为薄膜衣小片（0.32 g/片），生产厂家和批号为：厂家1，批号ZBC1810；厂家2，批号201905033；厂家3，批号180309；厂家4，批号3181019；厂家5，批号190319；厂家6，批号190508；厂家7，批号17120615；厂 家8，批 号20190102；厂 家9，批 号B19A026；厂家10，批号18112201。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合对照品储备液的制备 精密称取二氢丹参酮对照品10 mg置于250 mL棕色容量瓶中，加甲醇超声溶解，定容至刻度。再分别精密称取隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA对照品5 mg置于25 mL棕色容量瓶中，用40µg/mL的二氢丹参酮对照品溶液适量溶解，并定容至刻度，制得二氢丹参酮浓度为40µg/mL、其他三种成分浓度均为200µg/mL的混合对照品储备液，后续实验中所有的对照品工作液临用前均用0.22µm膜过滤，收集续滤液进样测定。

2.1.2 供试品溶液的制备 取复方丹参片10 片，称量总重，研成细粉，精密称取细粉约200 mg，置于10 mL 容量瓶中，加适量甲醇超声提取，定容后用0.45µm滤膜滤过，收集续滤液进样测定。

2.2 标准曲线法

2.2.1 色谱条件 色谱柱Ichrom C18（4.6 mm ×250 mm，5 µm）；流动相为甲醇-水（80∶20），流速1.0 mL/min；室温；进样量20µL；检测波长270 nm。

2.2.2 线性关系考察 精密量取混合对照品储备液，用甲醇将其稀释成一系列不同浓度的混合对照品工作液（其中二氢丹参酮的浓度为2、4、8、12、16、20 µg/mL；其他3 种成分浓度为10、20、40、60、80、100µg/mL）。按照“2.2.1”项下的色谱条件依次进样，并以浓度（c）为横坐标，对应峰面积（A）为纵坐标进行线性回归分析（见表1）。结果表明，在测定浓度范围内，这4种成分的线性范围良好。

表1 线性关系考察结果

2.2.3 稳定性实验 取云南白药集团的复方丹参片细粉按“2.1.2”方法制成供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h按“2.2.1”项下的色谱条件依次进样，得4种成分峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分 别 为3.00%、3.00%、2.00%、3.00%。结果表明，供试品溶液在8 h内稳定性良好。2.2.4 重复性考察 精密称取6 份云南白药集团股份有限公司的复方丹参片粉末200 mg，按“2.1.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.2.1”项下的色谱条件依次进样，测定这4 种丹参酮类成分的峰面积，计算RSD。结果表明二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA 4种成分的RSD分别为0.74%，1.23%，1.48%，1.02%，表明该方法重复性良好。

2.2.5 精密度考察 精密量取“2.1.1”项下的混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件，连续进样5次，测定4种丹参酮类成分的峰面积，并计算RSD。计算得二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA 峰面积的RSD 分别为1.17%、1.27%、1.75%、1.00%，说明本法精密度良好。

2.2.6 加样回收率 精密称取6 份云南白药集团股份有限公司的复方丹参片细粉200 mg，按“2.1.2”项下的方法制备样品溶液。精密量取该样品溶液和混合对照品溶液各1 mL 置于同一容量瓶中，得6 份混合溶液。按“2.2.1”项下色谱条件，测4 种药效成分的峰面积并计算回收率及RSD值（表2）。结果表明，回收率良好，本法准确度较高。

表2 二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA加样回收率结果

2.3 样品含量测定

将“2.1.2”项下制备的供试品溶液按“2.2.1”项下色谱条件进行含量测定，得到4 种成分的峰面积并计算其含量，结果见表3。

表3 10个厂家样品中4种丹参酮类成分的含量测定结果

2.4 QAMS法

2.4.1 相对校正因子测定 以丹参酮ⅡA（d）为内标，分别计算二氢丹参酮（a）、隐丹参酮（b）、丹参酮Ⅰ（c）的相对校正因子，在不同进样体积下的测定。结果见表4。

表4 不同进样体积下相对校正因子的结果

2.4.2 QAMS 法耐用性考察 考察使用岛津LC-20AT、岛津LC-2030 和Elite 高效液相色谱系统，以 及 使 用Thermo ODS-2 HYPERSIL、Ichrom C18、Agilent ZORBAXSB-C1 3 种不同厂家色谱柱对相对校正因子的影响，4 种待测成分在不同色谱柱和不同仪器上的相对校正因子，见表5。结果表明相对校正因子在不同高效液相色谱仪及色谱柱下的重现性良好。

2.4.3 QAMS 法待测组分色谱峰的定位 为了在仅采用丹参酮ⅡA 为对照品时，能够通过获得的相对校正因子同时计算3 种成分的量，达到一测多评的目的，本研究考察了使用不同仪器和不同色谱柱时丹参酮I、隐丹参酮和二氢丹参酮与丹参酮ⅡA 的相对保留时间，以观察待测成分色谱峰在色谱图上定位的准确性，见表6。丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和二氢丹参酮与丹参酮ⅡA相对保留时间的RSD分别为3.00%、1.28%、4.38%，表明相对保留时间可作为目标峰的定位参数。因此，通过丹参酮ⅡA 的保留时间，再根据相对保留时间，就可以判断出目标峰的准确位置。

表6 相对保留时间考察结果

2.5 统计学方法

采用SPSS 24.0软件进行数据分析，采用t检验对外标法和QAMS 法结果进行比较，采用单因素方差分析对10个厂家的复方丹参片进行组间比较，检验水准α=0.05。

2.6 外标法与QAMS法测定结果的比较

分别通过外标法和QAMS法计算所有厂家复方丹参片中4种丹参酮类成分的含量，结果见表7。对两种方法所得的4种成分含量测定结果进行t检验，二氢丹参酮的P值为0.828，丹参酮Ⅰ的P值为0.847，隐丹参酮的P值为0.738，表明两种方法所得的含量测定结果差异无统计学意义。

表7 外标法与一测多评法对10个厂家复方丹参片中待测成分的测定结果比较

2.7 不同厂家复方丹参片的组间方差分析

对10个厂家复方丹参片中的二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA 的含量分别进行组间方差分析，二氢丹参酮的P值为0.000 02，差异具有统计学意义；丹参酮Ⅰ的P值为0.006，隐丹参酮和丹参酮ⅡA的P值为0.011，不同厂家的4种成分含量差异均具有统计学意义。

3 讨 论

3.1 相对校正因子结果分析

实验证明在不同色谱柱、不同仪器等条件下，以丹参酮ⅡA 为内参物，相对校正因子重现性良好（RSD为2.29%～4.01%），又考察了使用不同仪器和不同色谱柱时丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和二氢丹参酮与丹参酮ⅡA的相对保留时间，可以判断目标峰的准确位置（RSD为1.28%～4.38%）。对外标法和QAMS 法所得的4 种有效成分含量测定结果进行t检验（P＞0.05），说明相对校正因子可用于计算复方丹参片中丹参酮类活性成分的含量，结果准确可靠。

3.2 不同厂家复方丹参片有效成分的含量对比分析

本实验对10个不同厂家复方丹参片中4种有效成分的含量进行比较。复方丹参片中丹参酮ⅡA等成分的含量符合2020版《中国药典》（一部）的规定，但不同厂家的复方丹参片有效成分的含量波动范围较大，其中二氢丹参酮的含量0.034～0.083 mg/片，隐丹参酮的含量0.118～0.381 mg/片，丹参酮Ⅰ的含量0.082～0.217 mg/片，丹参酮ⅡA 的含量0.221～0.427 mg/片，各有效成分的高低值相差2倍以上。考虑其原因可能是复方丹参片的原料和生产工艺的差别，不同产地的丹参生长环境不同导致丹参中的药效成分含量差异较大，如产地为陕西的复方丹参片中丹参酮类成分较高，主要是由于陕西气候、水分、光照等环境因素更适合丹参的生长［9-11］。丹参酮类成分热稳定性差、见光易分解，应在阴凉干燥（40 ℃～60 ℃）的条件下加工丹参药材［12-13］。在丹参提取液浓缩成膏时，可引入冷冻干燥等新工艺减少温度、光等因素对有效成分的破坏［14-15］。复方丹参片的临床疗效与内在质量有着密切关系，因此在生产过程中应严格控制温度、真空度、时间等参数，以保证质量一致性，提高临床疗效。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突