球磨辅助提取花生壳黄酮工艺优化及其抗氧化活性研究

吕东灿，侯婧霞，姜广策，李演鑫，李程鹏，王志敏,

（1.河南农业大学理学院，河南郑州 450002；2.商丘市中医院，河南商丘 476000）

我国是世界上最大的花生生产国，年产量占世界总产量约40%，花生加工业规模居世界之首。花生壳占花生总产量的30%左右，年产量近500 万吨，为花生壳的高附加值利用提供了丰富的资源[1]。但目前花生壳除少部分用于食用菌栽培、饲料加工、塑料填料和粘合剂等，大部分被燃烧或废弃，造成了资源的浪费和环境污染。花生壳主要由粗纤维[2]、碳水化合物和蛋白质等组成，还含有具有生理活性的黄酮类物质[3]，其中以木犀草素含量最高[4-5]。黄酮化合物在临床上具有止咳、祛痰、消炎、抗氧化、增强免疫功能、降血脂与胆固醇等药理作用，在医药、保健品和食品等领域具有广泛的应用前景[6]。花生壳黄酮的提取能够提高农副产品的经济效益，减少环境污染，对花生资源的综合利用具有重要意义。

黄酮类化合物难溶于水，易溶于有机溶剂如乙醇、乙醚和稀碱溶液中，从天然生物质原料中提取黄酮的工艺有溶剂提取法[7]、超临界提取法[8]、微波辅助提取法[9]、碱浸提法[10]、超声辅助提取法[11]、液-液微萃取[12]、酶辅助提取法[13]和协同提取法[14]等。现存的溶剂提取、微波辅助提取等技术由于提取过程温度较高，会部分抑制黄酮类的生物活性[15]；而超临界提取、微波等适用于工业化生产的设备研发相对滞后，仅限于实验室研究[6]。球磨法近年来被应用于材料合成[16]、改性[17]和膳食纤维的提取[18]等。机械辅助提取原理是高强度研磨促进细胞壁的破裂，促进有效成分的溶解[19]。Xie 等[20]的研究结果表明，球磨辅助提取获得的竹叶黄酮有更强的亲水性，竹叶黄酮的提取量为16 mg/g，证明了球磨对天然产物提取过程的促进作用。He 等[15]研究了球磨辅助提取中草药牛樟芝中的三萜类物质。与乙醇回流提取相比，球磨辅助提取三萜类物质的效率更高，相同浓度条件下的抗氧化活性也更高。Talekar 等[21]以水为溶剂采用球磨法成功地提取出石榴皮中的抗氧化物质安石榴甙。球磨法提取过程能量消耗少、提取效率高，是一种非常有前景的天然产物提取方法。然而，目前尚未发现球磨法应用于花生壳黄酮提取的研究。

基于此，本研究创新性地使用球磨法提取花生壳黄酮，以总黄酮提取量为考察指标，通过单因素和响应面试验优化花生壳总黄酮的提取工艺，同时考察球磨提取花生壳总黄酮的抗氧化活性，并使用紫外光谱和液相高分辨质谱分析花生壳黄酮中化合物。与其它方法相比，球磨法无需高温高压，生产成本较低；另一方面，低温提取过程能够保留黄酮类物质的活性，获得高效、抗氧化性能良好的黄酮，为提高花生壳的综合价值以及生物质资源的开发利用提供了理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

花生壳 品种为鲁花9 号大壳花生，产地为河南省宁陵县，10 月份采收，经水洗、干燥、粉碎后，过100 目筛备用；芦丁（>95%）、氢氧化钠、无水乙醇、三氯化铝、三氯化铁、冰醋酸、无水醋酸钠 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；木犀草素（≥95%）分析标准品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；邻苯三酚 分析纯，上海麦克林生化科技有限公司。

QM-3SP2 型行星式球磨机 南京大学仪器厂；ZLGJ-10 型真空冷冻干燥机 杭州瑞佳精密科学仪器有限公司；RE-52AA 型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；SB-600DTY 型超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；TU-1901 型双光束紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；CS-700 型高速多功能粉碎机 永康市天祺盛世工贸有限公司；AE124 型电子天平 舜宇光学科技有限公司；LC-20AT 高效液相色谱仪 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 花生壳黄酮的提取工艺 称取2.0 g 花生壳和60.0 g 球磨珠加入到玛瑙球磨罐中，按照一定的料液比、乙醇浓度和球磨时间进行球磨，提取液分离出球磨珠后，减压蒸馏以收集浓缩液，于4000 r/min离心10 min，收集上清液用75%乙醇定容至100 mL，于4 °C 保存备用。

1.2.2 花生壳黄酮提取量的测定 参考赵星等[22]的方法对黄酮进行定量。精确称取20.00 mg 芦丁标准品，溶解于75%乙醇溶液并定容至100 mL，经稀释得到不同浓度的标准溶液。精确量取0.5 mL 标准溶液或样品液于5 mL 刻度试管中，加入0.25 mL 0.1 mol/L 的氯化铝溶液和0.5 mL pH5.5 的乙酸钠-乙酸缓冲溶液，用75%乙醇定容至5.0 mL，摇匀静置15 min，经0.45 μm 滤膜过滤后在420 nm 测定吸光度值。以芦丁浓度c 为横坐标，吸光度值A 为纵坐标，芦丁标准溶液的曲线方程为A=0.00626c+0.02949，决定系数R2=0.9997。花生壳中黄酮提取量的测定公式为：

式中，Y 为花生壳黄酮的提取量（mg/g）；c 为样品中黄酮的质量浓度（mg/mL）；V 为样品溶液总体积（mL）；m 为花生壳样品的质量（g）。

1.2.3 花生壳黄酮提取工艺单因素实验 影响花生壳黄酮提取量的主要因素有料液比、球磨时间和乙醇浓度。固定乙醇浓度为70%，球磨时间为60 min，料液比为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g/mL ；固定乙醇浓度为70%、料液比为1:20 g/mL，球磨时间为20、40、60、80、100 min；固定料液比为1:20 g/mL、球磨时间60 min，乙醇浓度为30%、45%、60%、75%、90%进行单因素实验。

1.2.4 花生壳黄酮提取工艺响应面试验 根据单因素实验的结果，以花生壳黄酮提取量（mg/g）为响应面指标设计Box-Behnken 试验，响应面试验的因素和水平见表1。

表1 响应面试验因素水平设计Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.5 不同提取方法的比较 为探索球磨辅助方法的有效性，进行了超声提取[11]和加热回流提取[23]对比实验，料液比、提取时间和乙醇浓度分别为1:25 g/mL、60 min 和60%，超声辅助提取的功率为300 W，回流提取温度为70 °C。

1.2.6 花生壳黄酮的抗氧化活性测定 在碱性条件下，邻苯三酚自氧化产生超氧自由基阴离子O2-·，在320 nm 下有较强的吸光度。测定花生壳黄酮对邻苯三酚自氧化反应产生超氧自由基的清除能力，配制3 mmol/L 的邻苯三酚溶液，参照陈仕学等[24]和延莎等[25]的测定方法评价花生壳黄酮的抗氧化能力。

1.2.7 花生壳黄酮的结构鉴定 分别取0.5 mL 170 μg/mL 的芦丁标液和花生壳黄酮提取液，加75%乙醇定容至10 mL，在200～800 nm 范围扫描紫外光谱。

将花生壳黄酮提取液冷冻干燥处理，取样用70%乙醇稀释并经0.22 μm 滤膜过滤，参照唐丽萍等[26]的方法进行花生壳黄酮样品定性测定，因花生壳黄酮主要成分为木犀草素[10]，采用木犀草素标准品进行对照分析，色谱柱为C18柱，流动相为甲醇-水-乙酸（50:50:1），检测波长为254 nm。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比对黄酮提取量的影响 在乙醇体积分数为70%、球磨时间为60 min 条件下，考察料液比对黄酮提取量的影响，结果如图1 所示。花生壳黄酮化合物提取量随料液比的增大而增大，料液比从1:10 到1:20 大幅度增加，之后提取量增加幅度平缓。这是因为随着料液比增大，黄酮类化合物在乙醇中充分溶解出来。但乙醇溶液过多会导致除黄酮类化合物外其它溶于乙醇的物质被提取[27]或影响传质速率[28]，因此，当料液比大于1:30（g/mL）时，随着料液比的增加，黄酮类化合物提取量增加不明显。同时考虑成本问题，故选择料液比1:20、1:30、1:40（g/mL）为响应面分析的三个水平。

图1 料液比对花生壳中黄酮提取量的影响Fig.1 Effect of material to liquid ratio on the yield of flavonoids

2.1.2 球磨时间对黄酮提取量的影响 在料液比1:20 g/mL、乙醇浓度为70%，考察球磨时间对黄酮提取量的影响（图2）。花生壳黄酮提取量随球磨时间增大呈现先增大后减小的趋势。球磨时间为60 min时的提取量接近20 min 时提取量的2 倍，增加幅度明显；球磨时间在60～80 min 时提取量增幅较小，球磨时间继续增加，花生壳黄酮提取量呈下降趋势。球磨时间相对较短时，时间的延长可加强花生壳细胞的破碎程度，更易释放出黄酮类化合物。但球磨时间过长时，黄酮类化合物可能受到破坏或发生氧化[27,29]，从而导致提取量降低。因此，选择球磨时间为50、60、70 min 作为响应面分析的三个水平。

图2 球磨时间对花生壳中黄酮提取量的影响Fig.2 Effect of ball milling time on the yield of flavonoids

2.1.3 乙醇浓度对黄酮提取量的影响 在料液比为1:20 g/mL、球磨时间为60 min 条件下，考察乙醇浓度对黄酮提取量的影响。由图3 可知，花生壳黄酮类化合物提取量随乙醇浓度的增大呈现先增大后减小的趋势，这与范金波等[30]的研究结果一致。乙醇浓度从45%到60%提取量有大幅度的增加，黄酮类化合物提取量在乙醇浓度为60%时达最高，为31.02 mg/g，这可能是因为黄酮类化合物的极性与60%乙醇的极性相差较小，利于黄酮类物质的溶出[24]；当乙醇浓度超过60%，黄酮提取量反而下降，原因是乙醇浓度过高增大了体系的渗透压，从而影响黄酮的提取；另一方面，乙醇浓度增加使得醇类和脂类等物质的溶出[30]。由此选择乙醇浓度为50%、60%和70%作为响应面分析的三个水平。

图3 乙醇浓度对花生壳中黄酮提取量的影响Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on the yield of flavonoids

2.2 Box-Behnken 试验设计和结果

2.2.1 响应面试验设计及结果 以花生壳黄酮提取量为评价指标的响应值，选择料液比（A）、球磨时间（B）、乙醇浓度（C）进行三因素三水平响应面试验设计，Box-Behnken 试验设计和结果见表2，方差分析见表3。

表2 响应面试验设计和结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

表3 方差分析结果Table 3 Results of analysis variance

2.2.2 回归模型的建立及方差分析 以花生壳黄酮类化合物提取量为响应值，通过Design-Expert 软件进行回归分析，得二次多项回归方成为：Y=31.55-0.3625A+0.1687B-0.2562C-0.0375AB+0.2375AC+0.4000BC-0.6233A2-0.6358B2-1.81C2。由表3 可知，模型P=0.0010<0.01，表明模型极显著；失拟项P=0.5063>0.05，表明拟合方程可用于预测花生壳黄酮提取量的最佳工艺；方程的决定系数R2=0.9801>0.9，调整决定系数RAdj2=0.9444，表明此回归方程可以解释94.44%黄酮提取量的变化。此外，回归方程中一次项料液比（A）和乙醇浓度（C）对花生壳黄酮提取量的影响显著（P<0.05），球磨时间（B）的P值为0.1237，对花生壳黄酮提取量的影响不显著；交互项中球磨时间（B）和乙醇浓度（C）的交互作用对花生壳黄酮提取量的影响显著；二次项中A2、B2、C2的P<0.01，对花生壳黄酮提取量的影响极显著。由F值判断，料液比、球磨时间、乙醇浓度三个因素对花生壳黄酮提取量的影响程度为料液比（A）>乙醇浓度（C）>球磨时间（B）。

2.2.3 响应面试验中交互项作用分析 为分析因素的交互影响作用，对交互项作响应曲面图和等高线图。如图4，响应曲面越陡、弧度越大、等高线越密集、椭圆程度越大、红点靠近内圆的中心处，表明交互的两因素作用越显著[29]，对花生壳黄酮提取量的影响越大。其中，乙醇浓度和球磨时间的响应曲面较陡，等高线较最为密集，且椭圆程度较大，红点距离圆内中心较近，说明两因素间的交互作用显著。

图4 乙醇浓度和球磨时间对花生壳黄酮提取量的交互影响Fig.4 Response surface diagram of the effect between ethanol concentration and ball milling time on the yield of flavonoids

2.2.4 优化工艺的验证实验 通过Design-Expert 软件设计响应面试验优化花生壳黄酮提取量的条件，结果显示球磨辅助最佳提取工艺为料液比1:26.915 g/mL、球磨时间61.174 min、乙醇浓度59.220%，对应的黄酮提取量为31.623 mg/g。为了实际操作可行，球磨辅助最佳工艺条件修正为料液比1:25 g/mL、球磨时间60 min、乙醇浓度60%。在修正工艺条件下进行验证，得到提取量为（32.1±0.13）mg/g，预测值与实际值误差为1.48%，表明该模型具有一定的可行性。

2.3 花生壳黄酮提取量对比

本研究中，球磨法提取花生壳黄酮的最大提取量为32.1 mg/g，高于超声方法得到的黄酮提取量（23.2 mg/g），略低于回流提取法得到的黄酮提取量（32.9 mg/g）。与文献报道相比，球磨法的黄酮提取量远高于微波辅助法的花生壳黄酮提取量（2.165 mg/g）[30]、郑州大壳花生的黄酮提取量（19.6 mg/g）[31]和微波提取工艺黄酮提取量（29.18 mg/g）[32]，稍低于永州江永小壳型花生壳黄酮提取量（38.8 mg/g）[31]和乙醇回流提取的安徽花生壳黄酮提取量（39.8 mg/g）[23]。尽管花生壳品种和产地不同，会对花生壳黄酮提取量造成一定的影响。本研究中相对较高的黄酮提取量证明了球磨法的可行性。

2.4 花生壳黄酮抗氧化活性

球磨法得到的花生壳黄酮对超氧自由基清除能力如图5 所示。可见，球磨提取出的花生壳黄酮对超氧自由基阴离子形成具有明显的抑制作用。在一定范围内，花生壳黄酮对超氧自由基的清除能力随花生壳黄酮浓度的增大而增大，在实验范围内呈正相关。花生壳黄酮能够提供活泼的氢质子与自由基形成稳定的物质，阻断了邻苯三酚的自氧化过程。当花生壳黄酮浓度为0.012 mg/mL 时，对超氧自由基阴离子的清除率为53.53%。综上可知，球磨法提取花生壳黄酮除在降低能耗和提高提取量方面上有不可忽视的优势外，还保留了目标物的抗氧化活性，是一种具有工业前景的花生壳黄酮提取方法。

图5 花生壳黄酮对超氧自由基的清除能力Fig.5 Superoxide free radical scavenging ability of flavonoids in peanut shell

2.5 花生壳黄酮官能团分析

为探究花生壳提取物的官能团结构和验证以芦丁为标准检测其提取量的可靠性，进行了芦丁标准品和花生壳黄酮的紫外-可见光谱分析。如图6 所示，芦丁标准品和花生壳黄酮的出峰位置基本一致。位于240～280 nm 和330～400 nm 的峰分别是由C6-C3-C6（两个苯环通过三个碳原子而连接成的化合物）结构中A 环取代基和B 环取代基引起[33]。花生壳提取物的紫外光谱图中波长258 nm 处有小波动可能因为A 环上羟基或甲氧基取代基导致或是提取物未纯化引起，花生壳黄酮在344 nm 处的波峰向短波移动的可能是B 环上的羟基甲基化后转化成甲氧基所引起的。可见，花生壳提取物存在黄酮类化合物代表性的C6-C3-C6结构。

图6 花生壳黄酮和芦丁的紫外-可见光谱图Fig.6 UV-Vis spectra of flavonoids in peanut shell and rutin

木犀草素标准品和花生壳黄酮样品的HPLC图谱如图7 所示。木犀草素标准品的出峰时间为9.03 min；花生壳黄酮样品的液相色谱中9.06 min 位置的峰证明了木犀草素的存在，这与文献报道的花生壳黄酮的主要成分为木犀草素一致[26,34]。其它位置较小的峰是由于杂质存在引起的。

图7 木犀草素和花生壳黄酮样品的HPLC 图Fig.7 HPLC of luteolin and flavonoids in peanut shell

3 结论与展望

球磨辅助乙醇提取花生壳中黄酮的提取过程中，在一定范围内，料液比对花生壳黄酮的提取量影响最大，其次是乙醇浓度，球磨时间对黄酮提取量的影响最小。响应面优化结果表明，球磨辅助乙醇提取花生壳黄酮的最佳工艺为料液比1:25（g/mL），球磨时间60 min，乙醇体积分数60%，总黄酮提取量为32.1 mg/g。花生壳黄酮对超氧自由基阴离子具有较强的抗氧化能力，随着花生壳黄酮浓度的增加，抗氧化能力随之增强。黄酮样品经鉴定，其主要成分为木犀草素。球磨辅助提取具有操作简单、条件温和、成本较低和效率较高等优点，是一种非常有前景的花生壳黄酮提取方法，能够为花生壳的高附加值利用提供技术支持。