小鼠IL-1β原核表达及其与在布鲁氏杆菌侵染巨噬细胞中差异表达的初步研究

杨 馨，邹德颖，张 凯，常 江，常恒祯，战俊澎，郭 珣，刘益辛，程梦妍，韩 成，胡 盼，卢士英，李岩松，柳增善，任洪林

（吉林大学人兽共患病研究教育部重点实验室/人兽共患病研究所/动物医学学院，长春 130062）

IL-1β是机体抵御病原微生物入侵，对抗炎症反应和组织损伤、激活和加强免疫应答的强细胞炎性因子，还可在机体内外诱导二级细胞因子（如IL-6、趋化因子）的产生，在宿主防御感染中发挥关键作用［1］。IL-1β释放的信号传导通路分为两步：首先，第一信号由Toll样受体通过与其配体结合将信号传至细胞内，诱导IL-1β前体合成；其次，第二信号外源ATP与P2X7受体结合，激活NLRP3炎性小体，将pro-IL-1β剪切为有生物活性的IL-1β并分泌到细胞外［2］。胞质中IL-1β与白细胞介素-1受体（IL-1R）结合，通过MyD88/IRAK/TRAF6信号转导模式，激活NF-kB信号转导通路，进而导致参与炎症、宿主防御、凋亡抑制和组织修复蛋白质的产生［3］。

布鲁氏杆菌（Brucella）感染引起的人兽共患病，至今仍然在世界范围内流行，特别是在发展中国家［4］。布鲁氏杆菌作为一种兼性胞内寄生菌，通过在宿主细胞内形成含布鲁氏杆菌的布氏小体（BCV），与溶酶体结合，在内质网中形成一个安全的细胞内生态位并进行高效复制，从而避免被宿主免疫系统清除，不产生对细菌生存有害的强烈炎症，最终导致慢性持续性感染，是布鲁氏杆菌病治疗和预防的难点［5］。利用不同毒力布鲁氏杆菌菌株感染绵羊，发现IL-1β和IL-1Ra出现差异性表达，进而推测IL-1β在布鲁氏杆菌胞内寄生感染中发挥一定的作用［6］。因此，为研究IL-1β是否为布鲁氏杆菌在宿主细胞内维持存活提供条件，本试验利用猪种布鲁氏杆菌S2侵染RAW264.7细胞建立感染模型，检测IL-1β在转录和翻译水平上表达量变化，结合胞内细菌计数结果，初步探讨IL-1β与布鲁氏杆菌胞内寄生的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 3月龄雌性新西兰兔购于辽宁长生生物技术股份有限公司。

1.1.2 菌种与试剂 猪种布鲁氏杆菌弱毒疫苗S2株（Brucellasuis S2）、小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株、大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）和表达载体pET-28a（+）由吉林大学人兽共患病研究教育部重点实验室保存。克隆载体pMD18-T、连接酶SolutionⅠ、限制性内切酶XbaⅠ和XhoⅠ购自宝生物工程（大连）有限公司。DNA Marker、质粒小提试剂盒、DNA回收试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司。2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix和2×M5 HiPer Realtime PCR Super mix with Low Rox购自北京聚合酶生物科技有限公司。HRP标记的山羊抗兔IgG均购于Immunoway Biotechnology公司。重组Anti-GAPDH抗体购自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1IL-1β基因扩增 取小鼠肺组织0.2 g迅速磨碎，按照100 mg/mL加入Trizol试剂，提取总RNA；再反转录操作得到cDNA，-80℃保存。根据NCBI发布的小鼠IL-1β基因序列（NM_008361.4），利用Primer 6.0设 计 引 物，上 游 引 物 为F：5′-TGC TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA TATAATGGCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3′（下 划线部分为XbaⅠ酶切位点），下游引物为R：5′-CCGCTCGAGTTAGGAAGACACGGATTCCATGGTG-3′（下划线部分为XhoI酶切位点），引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。PCR扩增产物回收并连接克隆载体pMD18-T，同时将测序鉴定的阳性克隆保种备用。

1.2.2 构建表达载体及目的蛋白的分离纯化 将验证正确的pMD18-T-IL-1β质粒与原核表达载体pET-28a（+）分别用XbaⅠ和XhoⅠ进行酶切，10%的琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的片段，用SolutionⅠ于16℃连接过夜；再转化至DH5α感受态细胞中，涂布于含有氨苄青霉素的固体LB平板上，挑取单克隆，培养过夜，经菌液PCR后，选取阳性克隆子测序，测序鉴定正确后命名为pET-28a-IL-1β。

1.2.3 诱导重组蛋白表达及纯化 将重组质粒pET-28a-IL-1β转化BL21（DE3）感受态细胞中，挑取阳性单克隆菌株，接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃振荡培养至OD600nm为0.5～0.6，1∶1 000的比例加入1 mol/L的IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷），16℃下140 r/min诱导24 h。收集的菌体在冰浴条件下进行超声破碎至澄清透亮，收集超声后的上清液和沉淀制样进行SDSPAGE分析。再利用His标签镍离子蛋白纯化柱对重组蛋白进行纯化，洗脱杂蛋白，收集目的蛋白并透析浓缩，最后利用BCA蛋白定量检测试剂分析蛋白浓度。

1.2.4 兔源多克隆抗体的制备及效价测定 选择3月龄3 kg的新西兰兔，适应性饲养3 d后，耳缘静脉采集血，收集阴性血清。首免（0 d）按1.0 mg/只将重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分混合乳化，进行背部皮下多点注射。每7 d以0.5 mg/只将重组蛋白配伍等体积的弗氏不完全佐剂，加强免疫。42 d时进行心脏采血，收集血清-80℃保存。

将重组蛋白按每孔5μg/mL包被于ELISA板中，4℃过夜后加入5%脱脂乳37℃封闭1 h。PBST洗涤3次，将制备的多克隆抗体血清从1∶1 000倍比稀释至1∶512 000依次加入，免疫前血清作为阴性对照，PBS溶液作为空白对照，孵育1 h。二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG按1∶5 000稀释，最后加入100 μL四甲基联苯胺（TMB）反应8 min后加入50μL终止液，利用酶标仪测定OD450nm。

1.2.5 多克隆抗体特异性分析 利用LPS刺激RAW264.7细胞8 h，加入裂解液收集细胞总蛋白，与重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot试验。一抗多克隆血清按1∶1 000稀释，二抗是HRP标记的山羊抗兔IgG按1∶5 000稀释。

1.2.6 布鲁氏杆菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7模型建立 将对数生长期的RAW264.7细胞以每孔106个铺于6孔板，培养过夜。用猪种布鲁氏杆菌弱毒株S2以MOI=1∶100（细菌∶细胞）对细胞进行侵染，4 h后弃去培养基，利用PBS洗涤细胞3次并加入含有1%双抗的基础培养基作用1 h后，此时计为0 h。收集0、4、8、12、24 h细胞，用含0.5%TrizonX-100裂解细胞，梯度稀释，涂板，每组试验重复3次，计算不同时间段的CFU。

1.2.7 荧光定量PCR检测 在布鲁氏杆菌侵染RAW264.7细胞过程中，分别在0、4、8、12、24 h弃去培养基，加入1 mL Trizol试剂提取细胞总RNA，再反转录得到cDNA。利用Premier 6.0设计IL-1β和MyD88定量引物（表1），β-action作为内参基因，通过实时荧光定量PCR检测各基因的mRNA表达水平。PCR反应体系：2×M5 HiPer Realtime PCR Super 10μL、cDNA 1μL、引物各0.5μL、ddH2O 8μL。利用2-△△Ct方法计算目的基因在不同时间段的相对表达量。

表1 荧光定量PCR引物

1.2.8 Western blot检测 在侵染0、4、8、12和24 h后，弃去细胞培养基，每孔加入200μL裂解液，冰上裂解30 min，于4℃下1 200 r/min离心15 min，取上清液，用BCA蛋白试剂盒检测浓度。取等量的蛋白进行SDS-PAGE电泳并转移至PVDF膜，进行Western blot检测，以GAPDH为参照蛋白，并用Image J软件统计灰度值计算蛋白质相对表达量。

2 结果与分析

2.1 重组载体p ET-28a-IL-1β的构建

10%琼脂糖凝胶电泳结果显示，在810 bp处出现扩增条带（图1）。将测序正确的重组质粒pET-28a-IL-1β，进行XbaⅠ和XhoⅠ酶切鉴定，在810 bp处得到目的条带（图2），表明重组质粒构建成功。

图1 IL-1βPCR扩增结果

图2 重组质粒p ET-28a-IL-1β酶切鉴定

2.2 重组蛋白IL-1β表达纯化

将菌液超声破碎后，离心收集上清液和沉淀并进行SDS-PAGE电泳。结果表明，上清液和沉淀均能观察到大小约31 ku的目的条带，与预期大小相符，且重组蛋白主要在上清液中表达。通过镍柱对重组蛋白进行纯化，纯化后的蛋白进行SDS-PAGE鉴定，在约31 ku处可见目的蛋白条带（图3）。

图3 重组IL-1β的SDS-PAGE分析

2.3 兔源多克隆抗体血清效价和特异性检测

利用纯化的重组蛋白免疫小鼠5次后，采用ELISA方法检测血清中多克隆抗体效价。以未免疫前兔血清为阴性对照，当稀释至1∶25 600时，OD450nm为0.678，大于阴性对照的2.1倍，表明制备的多克隆抗体效价较高。

以收集的LPS刺激RAW264.7细胞的蛋白作为天然蛋白，与重组蛋白分别作为抗原，制备的多抗血清为一抗（1∶1 000稀释）进行Western blot检测。结果表明，两组在31 ku处均出现明显的特异性条带（图4）。

图4 重组蛋白的多克隆抗体Western blot鉴定

2.4 布鲁氏杆菌侵染RAW264.7细胞IL-1β和MyD88 mRNA转录差异分析

将生长状态良好的RAW264.7细胞利用猪种布鲁氏杆菌S2进行侵染，通过荧光定量PCR检测IL-1β和MyD88的相对表达量。与正常组相比，S2组的IL-1β、MyD88均呈上调表达，IL-1βmRNA随着侵染时间延长，先降低，至24 h快速升高；MyD88mRNA随着侵染时间延长，先降低，至24 h再升高（图5）。

图5 IL-1β和MyD88在不同时间的mRNA表达量

2.5 布鲁氏杆菌侵染RAW264.7细胞IL-1β蛋白表达差异分析

Western blot分析发现，在感染0至4 h IL-1β表达量无明显变化，8～12 h IL-1β表达量显著上升（图6），提示布鲁氏杆菌作为胞内寄生菌，可能通过削弱侵染前期IL-1β上调表达为其在胞内寄生创造适宜的环境，待布鲁氏杆菌在细胞稳定存在后，仍会刺激IL-1β上调表达。

图6 Western blot检测IL-1β蛋白表达量

2.6 布鲁氏杆菌胞内CFU计数

猪种布鲁氏杆菌S2株侵染巨噬细胞RAW264.7后，其细胞内细菌数变化如图7所示。布鲁氏杆菌在胞内的存活能力持续下降，数量呈下调趋势，但变化强度与感染时间有关。侵染0～4 h时，巨噬细胞发挥强劲的杀伤力，绝大部分布鲁氏杆菌死亡，胞内细菌快速减少。待侵染8～12 h后，内体布氏小体（eBCVs）逐渐向有利于布鲁氏杆菌在宿主细胞内复制布氏小体（rBCVs）转换［7］，同时IL-1β蛋白表达量仍在增加，炎症反应持续，因此胞内布鲁氏杆菌数量减少的趋势变缓。侵染到达12～24 h，细胞内MyD88和IL-1β明显上调，炎症反应加剧，细胞对布鲁氏杆菌的清除力度加大，胞内细菌数再次快速下降。

图7 布鲁氏杆菌S2株在RAW264.7细胞内的增殖

3 小结与讨论

截至2021年5月，中国共报告布病26 919例，且病例数呈现波动上升趋势［8］。人类感染布病主要是通过直接接触感染动物及含菌的分泌物，或摄入感染动物制品，如未经消毒的牛奶、未煮熟的牛羊肉等。布鲁氏杆菌感染会引起人出现以发热、疲劳、虚弱和体重减轻为特征的炎症性疾病；雌性动物流产或产死胎、弱胎；雄性动物睾丸炎或附睾炎，丧失种用价值［9］。目前，动物布病的主要预防手段是接种疫苗，但无法准确区别布病感染与免疫，造成大量免疫动物因血清阳性反应而怀疑感染，对全球的畜牧业经济造成巨大损失，影响社会公共卫生安全［10］。因此，探讨影响布鲁氏杆菌在宿主细胞内寄生的因素，对进一步防控和治疗布病起到重要的作用。

IL-1β是一种强促炎细胞因子，可由多种细胞合成与分泌，具有广泛的生物学作用，不仅能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能，还能促进其他炎症因子的释放，维持和放大炎症反应［11］。研究表明，布鲁氏杆菌感染RAW 264.7能诱导IL-1β的显著表达［12，13］。IL-1β是布鲁氏杆菌急性感染期敏感指标［14］。因此，本研究选取小鼠IL-1β的CDS区进行原核表达，利用pET-28a构建表达载体，16℃下利用IPTG诱导培养24 h后，可在上清液中诱导出大量重组蛋白。经镍柱纯化后，可得到无杂带且纯度较高的重组蛋白。通过免疫新西兰兔制备的多克隆抗体制能与重组蛋白IL-1β以及小鼠天然IL-1β结合，特异性好，可用于后续试验。

MyD88作为胞内重要的信号转导分子，通过募集IL-1R相关蛋白激酶（IRAK）等具有死亡结构域的信号分子，参与IL-1R和TLR诱导NF-kB途径［15］。研究表明，MyD88的破坏和结构改变会降低对IL-1β应答，缓解炎症反应［16，17］。MyD88在机体清除绵羊布鲁氏杆菌、山羊布鲁氏杆菌和牛种布鲁氏杆菌过程中发挥不可或缺的作用［18-20］。因此，在探讨布鲁氏杆菌侵染过程中IL-1β差异表达的同时，关注MyD88变化趋势，为后续研究IL-1β和MyD88基因的干扰或过表达对布鲁氏杆菌胞内寄生的影响提供思路。

在布鲁氏杆菌感染初期，巨噬细胞可发挥其杀伤功能，杀灭绝大部分侵入的细菌，少量存活的细菌仍会刺激细胞激活炎症反应，提高IL-1β表达量，促进细胞对细菌的清除，但MyD88的作用有待进一步验证。