分子印迹柱结合液相色谱-串联质谱法测定猪肌肉中4 种β-受体激动剂

宋世文，宋晓仪，梁 幸，唐淑军，曾定玲，文冠希

（深圳市质量安全检验检测研究院，广东 深圳 518101）

β-受体激动剂是人工合成的苯乙醇胺类药物，曾被用于动物饲料中以提高饲料的转化率，增加动物胴体的瘦肉率［1］。含有β-受体激动剂残留的动物性食品引起的食品安全事件已得到社会广泛关注。中国明令禁止在动物饲养中使用或在产品中检出此类药物［2］。分子印迹技术（Molecular Imprinting Technology，MIT）作为一项新型技术，具有与天然生物分子识别的专一性，同时又具有良好的稳定性，被广泛应用于样品前处理过程［2］。

研究通过优化分子印迹固相萃取（MISPE）上样、淋洗和洗脱溶剂的选择等净化条件及质谱条件，建立了快速检测猪肌肉中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗等4种β-受体激动剂的MISPE-UPLCMS/MS 分析的混合样品和单样品方法。混合样品法是利用其选择性强和灵敏度高的特点，采用10 个单样品组成混合样品先进行筛选，再对阳性混合样品进行单个检测，方法有较低的检出限和较高的精密度，在阳性率不高时，能对猪肌肉中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗进行准确的定性和定量分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC 超高效液相色谱（美国Waters公司）-QTRAP5500MS 串联质谱仪（美国AB Sciex 公司）、固相萃取装置、Oasis TM MCX 固相萃取柱（美国Waters 公司）；3-30K 台式高速冷冻离心机（德国Sigma 公司）；Supel MIP SPE（β-agonists，25 mg/10 mL，65 μm，美国Sigma 公司）；Affinilute MIP-SPE（β-agonist，EU Biotage 公司，25 mg/10 mL）；J2 全自动固相萃取浓缩仪（美国J2 SCIENTIFIC 公司）。

甲醇、乙腈均为色谱纯（德国Merck 公司）；甲酸为色谱纯（北京迪马科技有限公司）；乙酸为分析纯（上海润捷化学试剂有限公司）；乙二胺-N-丙基硅烷吸附剂（PSA），粒径40～60 μm（美国Agilent Tech）；C18 粉，40 μm（美国Agilent Tech）。克仑特罗（Clenbuterol）、莱克多巴胺（Ractopamine）、沙丁胺醇（Sblbutamol）、西马特罗（Bambuterol，纯度＞98%）标准物质购自农业农村部环境保护科研监测所。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制 准确量取100 mg/L 标准物质，用甲醇定容配制1 mg/L 混合标准贮备液。准确量取1 mg/L 混合标准贮备液，配制分别为0.01、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μg/L 的混合标准工作液。

1.2.2 液相色谱-质谱条件

1）色谱柱。Acquity LCBEH C18 柱（50 mm×2.1mm，17 μm，美国Waters 公司）；柱温40 ℃；流速0.3 mL/min；进 样 量5.0～10.0 μL；流动 相甲 醇（A）和0.05%（V/V）甲酸水溶液（B）。梯度洗脱程序：0～2.0 min，10%A～40%A，3.0～4.0 min，40%A～90%A；4.0～4.1 min，90%A，4.1～4.2 min，90%A～10%A，4.2～6.0 min，10%A。

2）离子源。电喷雾离子（ESI）源；正离子模式；多反应监测模式（MRM）；电喷雾电压为正离子5 500 V；离子源温度500 ℃；雾化气为60 psi ，辅助加热气1为45 psi；辅助加热气2为50 psi；气帘气30 psi。

1.2.3 样品准备

1）单样品准备。取有代表性猪肌肉组成样品300 g，先切成小块，用高速组织粉碎机充分粉碎，冷冻备用。

2）混合样品准备。将10 个备用的单样品，每个取30.0 g，组成混合样品，用高速组织粉碎机充分粉碎，冷冻备用。混合样品检测呈阳性的（≥LOQ），再对10 个单样品进行检测。

1.2.4 SPE 柱活化、上样和洗脱过程

1）MCX 柱。依次用3 mL 甲醇和3 mL 水活化；然后样品过柱；依次用3 mL 水、3 mL 甲醇水、3 mL甲醇清洗，用洗耳球挤干溶液；5 mL 5%氨水乙醇洗脱，用洗耳球挤干溶液。

2）MISPE 柱。依次用3 mL 乙醇、3 mL 水、3 mL 50 mol/L 乙酸铵（pH 6.7）活化；然后样品上清液过柱；依次用3 mL 水、3 mL 乙腈、2 mL0.5%乙酸/乙腈溶液淋洗，用洗耳球挤干溶液；用5 mL 10%乙酸/甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，用洗耳球挤干溶液。

1.2.5 样品预处理 称5.00 g混合样（单样品2.00 g）于50 mL 有盖离心管，加入10 mL 50 mmol 乙酸铵（pH 6.7），10 000 r/min 匀浆2 min，强烈振荡5 min，超声10 min。10 000 r/min 离心6 min，取上清液9 mL，加300 mg PSA 粉和300 mg C18 粉，强烈振荡3 min，放置5 min，取上清液8 mL 过柱。收集洗脱液，于50 ℃水浴下氮气吹至近干，用0.5 mL 0.1%甲酸水/乙腈复溶，过0.22 μm 滤膜，待测。液相色谱进样量混合样品10 μL（5 μL 单样品）。SPE 柱活化、上样、洗脱和浓缩过程也可用J2 全自动固相萃取浓缩仪完成。

2 结果与分析

2.1 仪器条件优化

为提高4 种β-受体激动剂检测的选择性和灵敏度，优化检测离子对的检测条件，以达到较好稳定性和较高灵敏度的统一，4 种β-受体激动剂类药物的保留时间及离子对优化质谱参数见表1。

表1 4 种β-受体激动剂类药物的保留时间及离子对质谱参数

2.2 净化效果比较

提取液组成复杂，含有脂肪、蛋白质和其他有机物质等杂质［2］。为提高净化效果，首先用PSA 粉和C18 粉除去了一部分杂质，再用固相柱净化。比较了Sigma-MIP、Biotage-MIP 与MCX 固相萃取的净化效果，4 种β-受体激动剂在猪肌肉中的添加浓度为0.25 μg/kg，多样品法测定，重复6 次，通过固相柱萃取净化后，应用LC-MS 测定，得到4 种β-受体激动剂的信噪比（表2）。信噪比高，表示净化效果好，检出限低。由表2 可知，Sigma-MIP 固相萃取能有效消除猪肌肉提取液基质对4 种β-受体激动剂的影响，信噪比最高，其他2 种固相柱只有不到Sigma-MIP 的50%。用变异系数代表稳定性，变异系数低，表示稳定性高；变异系数高，表示稳定性差。由表2可知，Sigma-MIP 固相萃取对4 种β-受体激动剂的稳定性最优，其他2 种在138%和159%以上。综合上述2 因素，选择Sigma-MIP 净化。

表2 3 种固相萃取柱净化效果的比较

2.3 方法的定量限和线性范围

单样品法添加浓度为0.1、0.2、1.0、5.0、10.0 μg/kg；混合样品法添加浓度为0.025、0.050、0.100、2.000、5.000 μg/kg；其中最低浓度（0.1 和0.025 μg/kg）重复6 次，其他浓度重复3 次。由表3 可知，该方法的定量限混合样品法为0.025 μg/kg，单样品法为0.1 μg/kg。该方法的定量限较国家标准（农业部公告1025号［3］，GB/T 22286—2008［4］）定量限LOQ更低，其中单样品法定量限是国家标准的1/15～1/4。该方法检定量低，可以作为多样品混合检测的依据。

表3 方法的定量限（与国家标准比较）和线性范围

2.4 方法的回收率和精密度

单样品法添加浓度为0.1、0.2、5.0 μg/L；混合样品法添加浓度为0.025、0.050、2.000 μg/L；每个梯度重复6 次。4 种β-受体激动剂加标回收率和精密度结果见表4 和表5。不同加标浓度下，加标回收率为61.3%～97.7%；精密度4.6%～12.6%，方法表现出良好准确性和稳定性。

表4 不同添加浓度的单样品添加回收率和精密度

表5 不同添加浓度的混合样品添加回收率和精密度

2.5 方法应用效率

根据公开资料［5］，深圳市2019 年畜禽产品1—9月抽检3 601 个样品，检测β-受体激动剂、磺胺、硝基呋喃等4 类20 个项目，发现超标样品22 个，超标率0.61%。其中，β-受体激动剂超标率小于0.1% 。根据公开信息［6］，2021 年全国抽检畜禽样品22 127份，检测项目18 项，总超标率1.2%，β-受体激动剂超标率小于0.1%。深圳市宝安区2018—2021 年4年共检测畜禽产品384 个，检测β-受体激动剂、磺胺、四环素类、喹诺酮类等5 类18 个项目，累计超标样品15 个，超标率3.9%；超标样品主要是四环素类和喹诺酮类，未见β-受体激动剂类物质超标。据农业农村部监测结果［7］，2017 年第三季度抽检农产品共10 594 个，β-受体激动剂合格率99.8%。可见，β-受体激动剂超标率是比较少的，不到0.2%。

在实际检测中，对超标率小于0.2%的情形，1 000 个单样品，可以组成100 个混合样品，由于阳性率小于0.2% ，只需2 个混合样品重新检测，所以相当于检测1 000 个单样，只需要检测120 次（100 个混合样和20 个单样），该方法效率是常规方法检测的8.3 倍。对超标率小于1%的样品，100 个单样品可以组成10 个混合样品，共需检测20 个样品（10 个混合样和10 个单样品），效率是常规检测的5 倍。因此该方法特别适用于超标率不高的大量样品使用，效率是普通方法5～8 倍。