山黧豆活性成分β-ODAP的检测方法研究进展

杨玲娟，焦成瑾，张小寒，赵菲佚

(1 天水师范学院 化学工程与技术学院，甘肃天水 741001； 2 天水师范学院 生物工程与技术学院，甘肃天水 741001；3 中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京 100083)

山黧豆(Lathyrussativus)不仅具有抗旱、耐寒、耐贫瘠等生物学特性，而且营养丰富(种子蛋白质含量可达25%～30%，将近是小麦的2倍)，一直作为优质的高蛋白小杂粮作物和饲料被广泛种植与利用[1]。另外，山黧豆还具有很强的抗重金属污染能力[2-3]，可作为环境修复植物用于重金属污染土壤或湿地的修复。但是，山黧豆的内源活性物质β-N-草酰基-L-α,β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-L-α, β-diaminopropionic acid，β-ODAP)在高浓度时表现为神经毒性[4]，使其作为高蛋白质植物资源的利用和开发受到限制。其实，β-ODAP不仅存在于山黧豆属植物中[5]，在猪屎豆属[6]、金合欢属[7]、苏铁[8]等植物的不同组织中也均有发现。在三七[9]、人参[10]、西洋参[11]等五加科名贵中药材中也分离鉴定出β-ODAP，并被命名为三七素(dencichine)。研究表明，β-ODAP既是山黧豆神经中毒的活性成分，又是三七的止血活性成分，而且还具有抗菌、参与Zn2+转运、清除羟基自由基、保护植物光呼吸代谢等其他生物活性；在山黧豆等豆类中，它还参与植物抗逆性等多种代谢反应活动[12-14]。然而，β-ODAP的同分异构体α-ODAP却基本无生物活性(图1)，在植物中含量也非常低，一般不超过5%(干重)[4]。

图1 β-ODAP及其异构体α-ODAP

由于山黧豆神经中毒涉及β-ODAP的神经活性作用，自1964年被分离鉴定以来，β-ODAP一直被视为山黧豆种植与利用的负面因子。出于毒理学、山黧豆低毒品种的选育、β-ODAP生物化学合成及影响因素等研究需要，不同学者建立了一系列β-ODAP的检测方法[14-15]。在三七、人参等中药材中的发现和鉴定则不仅使人们认识到它的功能多样性，而且极大地促进了其检测技术的开发[16]。回顾这些检测技术，一方面将帮助研究者选择合适的β-ODAP检测手段，另一方面将对开发其他氨基酸类植物次生代谢产物检测技术提供有价值的参考。

1 传统检测法

β-ODAP是一种游离氨基酸，早期的含量测定多采用检测氨基酸通用的分离及显色方法，如比色法、层析法和氨基酸自动分析仪法等。比色法是利用ODAP碱水解后的产物α,β-二氨基丙酸(α,β-Diaminopropionic acid，DAP)与邻苯二甲醛(O-Phthalaldehyde，OPA)在乙硫醇存在下能生成黄色化合物，在420 nm比色测定β-ODAP的含量[17]。该方法最早由Rao[18]创建，并经李志孝等[19]及Briggs等[20]进行了改进。该方法设备简单、成本低、显示灵敏，特别适用于大量样品的筛选分析。例如，Priyanka等[21]利用此方法测定了孟加拉国100个栽培山黧豆品种的ODAP，含量范围在0.13%～0.57%(干重)之间，并结合基因标记技术将这些山黧豆品种分成4个ODAP含量不同的组。Emmrich等[22]使用96孔板对比色法进行了改进并建立了检测β-ODAP的高通量平板光度法。在此基础上，郝晓鹏等[23]对137份国际山黧豆种质资源的叶片ODAP含量进行了检测，并据此将其划分为5个等级，其中高毒、低毒资源各8份[23]。在pH = 8时，β-ODAP的水解产物DAP在巯基乙醇存在下与OPA的反应产物具有很强的荧光(激发波长470 nm，发射波长530 nm)，借此建立了β-ODAP的荧光光度分析法，线性范围为0.01～1 μg/mL，其灵敏度比普通可见光比色法高2～3个数量级[24]。

薄层层析(thin layer chromatography，TLC)和高效薄层层析法(HPTLC)采用吸附、分配、离子交换等不同分离介质，依据不同组分比移值的差异实现分离测定。Paradkar等[25]采用TLC法快速检测ODAP以判定豆制品中是否掺杂了价格低廉的山黧豆，焦成瑾等[26]利用阳离子树脂交换分离与TLC分离相结合，将ODAP与山黧豆中其他氨基酸完全分开。Tarade等[27]用正丁醇-吡啶-水(10∶10∶5,V/V/V)为展开剂、0.2%茚三酮溶液显色、光密度仪测定ODAP含量，对3种烹饪方法加工的山黧豆食品中的ODAP降解动力学进行了详细研究。章观德等[28]利用荧光胺与β-ODAP反应，高效薄层层析法检测了不同三七头中β-ODAP含量，发现含量范围在0.316%～0.382%之间。

氨基酸自动分析仪分析法是基于阳离子交换柱分离、柱后用茚三酮显色、光度法测定氨基酸含量的分析方法。李天荣等[29]建立了山黧豆β-ODAP检测的氨基酸分析仪法，并用来分析水分胁迫对山黧豆萌发过程中β-ODAP和氨基酸的影响[30]。此外，氨基酸分析仪法还用于三七、人参、鲜人参和红参中的ODAP含量测定[31-33]，为这些药材止血效果的评估提供了重要参考。

总之，传统分析法仪器设备简单，易实现，灵敏度和准确度也比较低，不能有效区分β-ODAP与α-ODAP，但特别适合处理大量筛选或分等级的样品材料，尤其在野外或实验条件比较差的研究中工作效率很高。因此，这一方法至今仍广泛使用。

2 高效液相色谱法

2.1 直接检测法

除芳香族氨基酸外，绝大多数氨基酸在近紫外区无吸收，因此不能直接用紫外检测器测定其含量。ODAP分子中含有草酰基团(图1)，而草酸本身有紫外吸收(210 nm附近)，因此，不少学者利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)以紫外检测器直接测定生物样品中草酸的含量[34-35]。国内三七等中药材料的β-ODAP检测方法主要基于此原理。崔秀明等[36]在213 nm处建立了三七中β-ODAP的直接HPLC检测方法，发现云南文山产的三七中β-ODAP含量比较高，花蕾、茎叶、根茎、主根、侧根和须根含量分别为0.86%、0.37%、0.88%、0.52%、0.41%和0.89%；付春梅等[37]在220 nm下检测，发现云南三七制品中β-ODAP含量范围在0.561%～0.582%之间；谢国祥等[38]将样品抽提液在HPLC仪中直接进样，在214 nm下检测，从商品三七干燥根中分离纯化了β-ODAP，并用质谱法进行了确认；张玉萍等[39]在213 nm下检测发现商品三七片中的β-ODAP含量范围在0.428%～0.435%之间；山丽梅等[40]在213 nm下系统检测了云南文山三七产业园中的各种规格的三七头，发现商品规格最差的“无数头”中β-ODAP含量最高，可达1.02%，并且止血效果也最好，而商品规格最高的“13头”至一般规格的“120头”的含量在0.52%～0.69%之间，止血效果也一般，从而第一次发现三七头的止血效果与商品规格不相关，而与β-ODAP含量呈正相关，进一步证明β-ODAP的止血效果；刘光等[41-42]利用HPLC在213 nm检测了三七干燥根和根的总皂苷提取废液中β-ODAP含量，为废液中β-ODAP的回收利用提供了重要参考。

基于草酸紫外吸收的直接HPLC法操作简单，但易受样品中有机酸，尤其是游离草酸的干扰。本课题组采用此方法分析三七和山黧豆中β-ODAP含量时发现，在C18色谱柱中，草酸与β-ODAP的保留时间几乎重合，而且草酸的存在会干扰β-ODAP与α-ODAP的有效分开。植物新鲜样品中一般都存在含量可观的草酸，尤其是山黧豆幼苗组织；另外，样品加热处理过程中也容易发生β-ODAP向α-ODAP转化[43]，更重要的是直接检测法显然无法区分ODAP的两种同分异构体，导致检测结果偏高。因此，山黧豆等材料的β-ODAP检测一般很少用此方法。

对于无明显可见光吸收的物质来说，蒸发光散射检测器(evaporative light scattering detector, ELSD)和电雾式检测器(charged aerosol detection，CAD)也是HPLC中广泛使用的通用检测器[44-46]。样品抽提液过滤后也可直接进样进行检测。通过ELSD检测器[47]和CAD检测器[11]分别对不同类型的三七及西洋参中的β-ODAP进行HPLC法测定，结果与其他检测方法相似。

直接进样检测β-ODAP之所以能获得比较准确的结果正是得益于HPLC的良好分离能力，即不管采用哪种检测器，均遵循先分离再检测。所以，只要能控制好β-ODAP和α-ODAP在HPLC柱子中的分离效果，理论上不管用哪种检测器均能得到准确的检测结果。

2.2 间接检测法(柱前衍生法)

由于β-ODAP和α-ODAP的偶极距差别不大，即它们的极性很相近，在广泛使用的C18色谱柱中很难完全分开。但是与适当的衍生化试剂反应后两者产物的偶极距显著增大(表1)[48]，这样相应增大的极性差别足以使衍生物在C18柱中分开。这正是各种柱前衍生法的分离检测优势。

表1 β-ODAP和α-ODAP及其部分衍生物的偶极距[48]

柱前衍生检测法解决了ODAP紫外吸收弱、极性强不易在色谱分析碳柱中保留、两种异构体不易分离等问题，是测定β-ODAP应用最为广泛的一种分析方法。但不同的衍生试剂，反应条件、衍生物稳定性、分离效果、β-ODAP保留时间等具有明显差异。

2.2.1 邻苯二甲醛衍生法氨基酸与OPA反应产物(图2)既可以紫外检测，也可以荧光检测[49]，该方法检测β-ODAP最早由印度学者Rao建立，后被称为“Rao法”[50]。该方法操作相对简单，准确灵敏，样品量少；灵敏度比茚三酮高出10 倍；衍生试剂不干扰分离与检测，不必除去过量试剂；能有效分离β和α两种异构体。缺点是β-ODAP事先需要水解，衍生产物不稳定，需要及时测定，而且β-ODAP的出峰时间比较长。如Thippeswamy等[51]在β-巯基乙醇存在下，用邻苯二甲醛衍生化山黧豆种子粉提取物，在340 nm下检测得到β-ODAP的灵敏度为(1.54±0.04) mg/L，在C18柱中的保留时间为13.6 min。Hussain等[50]对6个不同实验室的改进方法与Rao的原始方法进行对比，发现不同方法的检测结果有明显的出入。通过反复试验，发现保证检测结果重复性的关键是使用0.5 mol/L 四硼酸盐作为缓冲液，并将这种新方法命名为Campbell法。

图2 氨基酸与OPA的反应

2.2.2 9-芴基甲氧基碳酰氯衍生法9-芴基甲氧基碳酰氯(9-fluoreneylmethyl chloroformate, FMOC)一般用于合成多肽的氨基保护剂，与带有伯及仲氨基的氨基酸反应可生成具有荧光(也有紫外吸收)的衍生物(图3)。因此，可以利用FMOC作为柱前衍生试剂测定氨基酸[52]。Kisby等[53]针对OPA-DAP衍生物的不稳定性，建立了以FMOC为衍生试剂，荧光检测ODAP含量的方法。对该方法改进后检测山黧豆种子中ODAP含量，检出限可达到皮摩尔(pmol)水平[54]。朱静等[55]对三七根粉的检测中，以硼酸缓冲液为反应介质，在室温下仅需1 min即可完成反应。说明该方法灵敏度高，产物稳定，反应不受样品基质的干扰，但缺点是无法区分ODAP的两个异构体。不过，在山黧豆干种子和三七干根粉中几乎不含α-ODAP。

图3 氨基酸与FMOC的反应

2.2.3 异硫氰酸苯酯衍生法异硫氰酸苯酯(Phenylisothiocyanate，PITC)是常见的氨基酸衍生化试剂(图4)。它作为柱前衍生试剂可有效的区分β-ODAP和α-ODAP，衍生反应在室温下仅10 min即可完成；产物在紫外区有强吸收(254 nm)，性质稳定，在室温数小时或冰箱数周后均稳定不分解，表现出诸多优点。利用这种方法，Khan等[56]分析了山黧豆幼苗中的β-ODAP含量；Kuo等[57]发现β-ODAP广泛存在于人参的种子、幼芽、秧苗和茎中。种子中β-ODAP的含量与山黧豆中的含量相近，占种子游离氨基酸的70%左右。对不同地区、不同基因型的山黧豆中β-ODAP及其他游离氨基酸分析发现，所有山黧豆样品中的高精氨酸含量均为最高，β-ODAP次之；但不同品种的含量变化较大[58]。但是，衍生反应完成后需真空干燥以除去过量衍生试剂，衍生物不具有荧光，方法灵敏度不够高，PITC易降低柱的寿命。

图4 PITC与氨基酸的反应

2.2.4 2,4-二硝基氟苯衍生法兰州大学李志孝课题组用2,4-二硝基氟苯(2,4-Dinitrofluorobenzene，FDNB)为衍生试剂建立了检测β-ODAP可靠的方法[59](图5)。1 mL样品萃提液(或氨基酸标准溶液)真空干燥后加入100 μL 0.5 mol/L的NaHCO3溶液溶解，然后加入100 μL FDNB衍生化试剂(100 mg FDNB溶解于100 mL乙腈，每日新制)混匀，于60 ℃加热30 min，冷至室温，加入0.01 mol/L的KH2PO4溶液，旋混数秒，0.45 μm滤膜过滤，取20 μL进行分析，β-ODAP和α-ODAP可良好分离。黄海霞等[60]采用此方法同时测定了三七不同部位三七素和18种游离氨基酸的含量。该方法的最大优点是β-ODAP和α-ODAP衍生物最先出峰(保留时间2～4 min)，大大缩短了分析时间。

1. β-ODAP；2. α-ODAP；3. 天冬氨酸；4. 丝氨酸；5. 谷氨酸；6.精氨酸；7. DNB-OH；8. 组氨酸；9. 高精氨酸；10. 苏氨酸；11. 丙氨酸；12. 脯氨酸；13. 半胱氨酸；14. 酪氨酸；15. 缬氨酸；16. 甲硫氨酸；17. 赖氨酸；18. 异亮氨酸；19. 亮氨酸；20. 苯丙氨酸

张海霞等[61]和赵兴秀等[62]进一步优化了色谱条件，采用恒组分洗脱测定了山黧豆中β-ODAP的含量，并对β-ODAP的提取方法进行了筛选。天水师范学院焦成瑾和杨玲娟课题组采用乙腈和HAc-NaAc(17∶83，V/V)为流动相，恒组分洗脱，使色谱峰峰形得到优化(图6)[48]，在0.40 μg/mL～1.2 mg/mL范围内线性关系良好；并以此分析了三七和山黧豆不同组织中β-ODAP和α-ODAP含量[63-64]。该方法的缺点是反应时间长(30 min)，反应温度较高(60 ℃)，导致α-ODAP的比例升高，但转化导致的误差通过标准品消除，不影响检测结果。

保留时间为3.576和4.073的峰分别为β-ODAP和α-ODAP的衍生物

2.2.5 其他衍生试剂法测定β-ODAP的柱前衍生试剂除了上述几种之外，还有对硝基卞氧基碳酰氯(PNZ-Cl)、丹磺酰氯(Dansyl-Cl)、6-氨基喹啉机-N-羟基丁二酰亚氨基甲酸酯(AQC)等。Jia等[65]和Yan等[66]利用PNZ-Cl为衍生剂在260 nm检测了山黧豆中ODAP的两种异构体，同时分析了其中的高精氨酸和生物胺的含量。该方法在室温下2 min即可完成衍生，产物稳定，缺点是需梯度洗脱，ODAP的两种异构体夹在其他氨基酸中间出峰。Dansyl-Cl衍生物法最早由Tapuhi等[67]提出，Xing等[68]将其应用于山黧豆中β-ODAP和α-ODAP的测定，衍生反应在60 ℃下25 min完成。该方法衍生物稳定，线性关系良好(相关系数为r> 0.999)，对β-ODAP的检测限为2～3 ng、平均回收率为98%，可以将山黧豆样品中游离氨基酸及α-ODAP和β-ODAP很好的分离；但反应时间需严格掌握。此外，AQC也可应用于测定山黧豆样品α-ODAP和β-ODAP的含量[69-70]，其保留值分别为6.07和3.85 min，并且与其他氨基酸分离良好，但衍生物在室温下易分解[71]。

总之，间接法通过与特定的衍生试剂反应，为ODAP分子引入苯环或共轭键，一方面使ODAP分子具有紫外吸收或发射荧光而便于检测，另一方面还可以明显改善分子的偶极矩，增大α-ODAP和β-ODAP极性差异，有效分离这两种同分异构体。相应衍生反应的条件、需要的时间、产物的保留时间以及检出限因衍生试剂而显著不同(表2)。

表2 不同柱前衍生试剂检测β-ODAP结果比较

3 色谱-质谱法

色谱-质谱联用法是将高效率的色谱分离与高灵敏度的质谱鉴定相结合的分析技术，可以很好地解决复杂化合物的分离及分析问题。Pan等[8]用N-乙氧甲酰乙酯(N-ethoxycarbonyl ethyl ester，ECEE)作衍生化试剂，通过GC-MS技术对9种苏铁种子的成分进行了鉴定，发现其中2种苏铁种子(Macrozamiamoorei和M.communis)含有β-ODAP。Xie等[72]用氯甲酸乙酯(ethyl chloroformate，ECF)为衍生试剂，以2-氯苯丙氯甲酸乙酯为内标，测定了三七中β-ODAP及其他21种氨基酸的含量，β-ODAP的检出限为0.5 μg/mL，提取液中含量为2 μg/mL。针对β-ODAP熔点高且存在异构化现象，朱静等[73]选用液相色谱-质谱联用技术研究三七素的两个对映异构体在兔子体内的代谢动力学，发现D型、L型三七素在家兔体内的代谢行为基本一致，都符合二室模型；建立的HPLC-MS方法对D型和L型三七素的检出限分别是10和8 ng/mL。张勇等[74]以羧甲司坦(carbocystelne)为内标，以甲醇为衍生试剂，生成三七素双甲酯衍生物(羧甲司坦双甲酯衍生物)，应用串连质谱(LC-MS-MS)法分析了三七素在大鼠及犬体内的分布、代谢和排泄情况，该方法的线性范围为0.02～50 μg/mL，大鼠血液中β-ODAP的浓度检出限为0.02 μg/mL，血浆中的提取回收率为97.1%。值得关注的是，采用稳定同位素标记的di-13C β-L-ODAP作为内标物进行高灵敏度LC-MS检测，可准确测定山黧豆、豌豆和鹰嘴豆中低含量的β-ODAP，用以判定这些作物不同组织中是否含有β-ODAP[22]。这一同位素内标法被誉为测定β-ODAP的“金标准”。

4 毛细管电泳法

毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)技术是以高压电场为驱动力，毛细管为分离通道，利用样品中不同带电微粒的电迁移速度不同而实现分离的一种手段。目前CE技术在药物分析中有非常广泛的应用[75]。郑萍等[76]应用毛细管区带电泳(CZE)，195 nm紫外检测，测得三七药材中β-ODAP的含量在0.583%～0.659 %之间，这个测定范围与其他方法的测定结果相近。Arentoft等[77]及Zhao等[78]利用CZE测定了山黧豆种子、苗及叶中的β-ODAP和α-ODAP含量，测定结果与HPLC法的结果基本接近。CE法能彻底分离β-ODAP、α-ODAP，操作简单，快速，成本低，适于对大量样品的筛选测定。

5 酶 法

由于酶对底物具有高效且高度专一性的催化效率，利用酶对特定化合物进行识别和含量测定，即为酶分析法。Rao等[79]首先提出用酶法测定β-ODAP的方法。山黧豆样品提取液经阳离子交换层析及酸水解后加入二氨基丙酸-氨裂合酶，37 ℃保温45 min后加入0.2%的2,4-二硝基苯肼，于520 nm处比色测定，以无活性酶样品为空白对照，方法可准确到5 μg。此外，可通过谷氨酸氧化酶(glutamate oxidase，GlOx)催化β-ODAP氧化分解来检测β-ODAP。GlOx氧化分解β-ODAP时会产生H2O2，H2O2在过氧化物酶(辣根过氧化物酶)的催化下氧化还原性染料使其变色，以光度法分析氧化前后吸光度的差异间接测得β-ODAP的含量[80](图7)。十多年来，Moges等[71]为提高检测灵敏度，对该方法进行了大量改进，但至今仍未开发出能实际应用的GlOx酶传感器。Peng等[81]从绵羊瘤胃中分离到了形态不同的3种球菌，它们都可以分解利用β-ODAP。如果能从中分离出分解β-ODAP的酶，进一步开发出酶传感器，则β-ODAP的检测会更加简便快捷，特异性好。

图7 酶传感器检测β-ODAP的反应机理示意图[71]

6 展 望

目前虽然已经明确β-ODAP的止血活性和神经兴奋性作用，但两种不同功能的分子机理至今不完全清楚，对β-ODAP多样性生物活性涉及的分子机理进一步阐明将无疑拓展人们对这一神奇氨基酸的应用领域。进一步的深入研究需要纯度较高的β-ODAP和高灵敏度的检测方法。纯品β-ODAP的获取途径不外乎从天然植物资源中分离提纯和化学合成两种途径。近年出现的分子印迹(molecular imprinting，MI)靶向天然产物分离制备技术因其具有的特异性识别特点而受到广泛重视[82]。该技术预先以天然产物活性成分或其结构类似物为模板分子，制备具有特异性识别功能的高分子聚合物，并以其为分离材料，从天然产物中分离得到目标活性成分。谢宏凯等[83]通过MI技术制备了对三七素具有高度选择识别性和高吸附容量的聚合物，将此聚合物用作固相萃取吸附填料，定向分离制备了三七中的β-ODAP。吸附实验证明分子印迹靶向聚合材料最大吸附容量为0.185 mmol/g，在15 min内即能达到吸附平衡，靶向分离三七素，其纯度高达98.7%，平均回收率为83.7%。以MI为介质制备的小柱在β-ODAP检测样品前处理中也将会有事半功倍的效果。

除以上提及的β-ODAP主流检测方法，还有一些属很少使用但在特定场合下实用的检测手段。目前，柱前衍生色谱法是β-ODAP研究中应用最为广泛的分析方法。柱前衍生解决了ODAP紫外吸收弱、极性强、不易在C18柱保留、两种异构体不易分离等问题。衍生试剂多样，衍生简单，分析效率高，大多能有效分离两种异构体。毛细管电泳和液质联用法因其高效的分离能力和高灵敏度被广泛应用于极难分离组分的分离；稳定性同位素内标法的LC-MS被誉为检测β-ODAP的“金标准”，可准确、灵敏、定性定量分析低含量ODAP样品。由于ODAP热异构化现象的存在，常温提取，常温检测将是β-ODAP检测方法努力的方向之一，因此，以MI法制备提取，以新型的特异性固定化酶电极或传感器作为检测手段将是未来β-ODAP分析检测的研究方向。