酯化大豆蛋白的制备及抑菌性研究

◎ 陈 菲，武若飞，萨日娜，姚英杰，许 晶

（东北农业大学 文理学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

大豆分离蛋白（Soy Protein Isolate，SPI）作为一种重要的植物蛋白产品，主要由大豆球蛋白（11S，52%）和β-伴大豆球蛋白（7S，35%）组成，其蛋白质含量高达90%以上，具备乳化性、溶解性和发泡性等功能特性[1-2]。这些良好的功能特性使大豆蛋白在食品方面有着广泛的应用，如应用于烘焙食品、面制食品等食品产业[2]。相关研究表明，当溶液pH值与大豆蛋白等电点（pH=4.5）相近时，蛋白质会因为表面所带电荷较少以及疏水相互作用增强的影响，以聚集体的形式存在，此时蛋白质的溶解性较差，这限制了其在一些偏酸性食品（如乳制品饮料）中的应用[3-4]。除此之外，天然蛋白容易腐败，滋生多种微生物，不易保存，为延长蛋白类食品的保质期，往往需要向其中添加一定量的化学防腐剂，而食品配方中含有化学防腐剂可能会给产品认可度带来消极影响。

近年来，一些研究学者利用化学改性技术，试图改善蛋白质在酸性条件下的功能性质。有研究发现，酯化改性不仅可以改善蛋白质在酸性条件下的溶解度，还可以使蛋白质表面携带正电荷[5]。当酯化蛋白表面携带的正电荷与细菌表面的负电荷成分进行相互作用时，可以使细胞膜表面被撕裂或形成孔洞，导致细胞内溶物泄露、细菌凋亡，从而对细菌的生长、繁殖起到抑制作用。因此，酯化蛋白既有在酸性条件下生产乳类食品的潜能，又能够作为天然防腐剂抑制有害微生物的生长繁殖。然而，现阶段将酯化改性蛋白应用于酸性食品的研究较少。基于上述背景，本文分别以SPI、11S和7S 3种大豆蛋白质为原料，制备酯化大豆蛋白MSPI、M11S和M7S，研究酸性条件下酯化大豆蛋白对微生物的抑制作用，为大豆蛋白在酸性食品中得到更广泛的应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与菌种

低温脱脂大豆粕粉从山东招远食品有限公司购买。大肠杆菌（E. coli，革兰氏阴性菌）、沙门氏菌（Salmonella，革兰氏阴性菌）以及金黄色葡萄球菌（S. aureus，革兰氏阳性菌）都来自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 仪器与设备

FT200-SH数显高速均质分散机（上海标本模型厂）、LYOQUEST-85PLUS冻干机（Telstar仪器公司）、SC-3610型低速离心机（安徽中科中佳科技股份有限公司）、IRTracer-100红外光谱仪（Shimadzu仪器公司）、Zetasizer Nano Zeta电位分析仪（Malvern仪器公司）、手提式压力蒸汽灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司）及L-8800氨基酸分析仪（Hitachi仪器公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白质的提取

在WANG等[6]的实验方法上加以修改，按照图1的流程对SPI进行提取，图2的流程对11S和7S进行提取，并利用凯氏定氮法确定SPI、11S和7S的蛋白含量分别为91.35%、80.32%、84.65%。

图1 SPI的提取流程图

图2 11S和7S的提取流程图

1.2.2 氨基酸分析

准确称取50 mg蛋白质，加入10 mL HCl（6 mol·L-1），用氮气吹扫15 min，置于烘箱中（110 ℃）水解1 d。取出，待其自然冷却到室温，对样品进行全部过滤，并定容在50 mL容量瓶中。准确移取1 mL样品，放入真空浓缩仪中浓缩至干，加入1 mL上样缓冲液，使蛋白质完全溶解。将溶解后的样品过0.45 μm滤膜，移取500～1 000 μL进行氨基酸分析。

1.2.3 蛋白质的酯化改性

（1）酯化大豆蛋白的制备。在SITOHY等[5]的实验方法上加以修改，将浓甲醇（＞99.5%）、盐酸和无水乙醇低温冷藏，4 ℃下按2%～7%（W/V）的物料比将蛋白样品加到浓甲醇中。反应开始时，逐滴加入12 mol·L-1的盐酸至最终浓度分别为0.7 mol·L-1、1.5 mol·L-1、3.0 mol·L-1，4 ℃下连续搅拌 2 h、4 h、6 h、8 h、10 h和12 h，抽滤得到固体产品。用等体积无水乙醇清洗，重复操作3次去除残余盐酸和甲醇，并用超纯水溶解沉淀物，使酯化蛋白固体在水中分散，4 ℃下透析3 d，冻干，得到3种酯化大豆蛋白（MSPI、M11S、M7S），-20 ℃保存备用。

（2）酯化率的测定。依据CHANG等[7]的实验方法，准确移取0.25 mL样品溶液（5 mg·mL-1）与0.15 mL的EDTA（0.05 mol·L-1）混合，涡旋的同时加入0.25 mL的盐酸羟胺（1 mol·L-1），再加入0.1 mL NaOH（6 mol·L-1），涡旋 1 min；在 75 ℃下水浴加热5 min，取出，自然冷却至室温，加入0.8 mL HCl（1 mol·L-1），再次涡旋1 min；离心，取上清液，并向上清液中加入80 μL FeCl3·6H2O溶液（5%W/V），在475 nm处测定吸光度。

通过乙酸乙酯标准曲线得出酯化蛋白含有的酯基摩尔数，根据酸性氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）含量计算蛋白质中游离羧基的总含量[5]。结果表明，每克SPI、11S和7S中羧基的摩尔数分别为1.048 mmol、1.334 mmol和1.244 mmol。最后，按照下式计算蛋白质的酯化率：

式中：M1为酯化蛋白含有的酯基摩尔数；M2为天然蛋白含有的游离羧基总摩尔数。

1.2.4 红外光谱测定

参考SUN等[8]研究方法，将样品与溴化钾按照质量比1∶100混合均匀，压成固体制片。使用FT-IR光谱仪，调节仪器参数分辨率为4 cm-1，设定波数范围为400～4 000 cm-1，进行红外光谱测定，扫描64次。

1.2.5 Zeta-电位测定

参考LI等[9]的研究方法并稍作修改，使用Zeta电位分析仪测定样品的Zeta-电位。测量之前先用10 mmol·L-1磷酸盐缓冲液（pH=5.0～9.0）将样品进行稀释，避免多重光散射效应。

1.2.6 抑菌性分析

实验中所用到的试剂和器材均事先进行高压蒸汽灭菌再冷却至室温，备用。依据SITOHY等[5]研究方法并稍做修改，移取20 mL灭菌后的营养琼脂培养基于玻璃平皿中，自然冷却，待凝固后备用。用无菌生理盐水将1 mL含108～109CFU·mL-1细菌（革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌）的营养肉汤培养基稀释至106CFU·mL-1，制成菌悬液。移取100 μL菌悬液，将其均匀涂布在营养琼脂培养基上，轻轻放置牛津杯，并向杯中加入150 μL样品。为消除缓冲溶液对实验结果的影响，使用只含有天然SPI、11S和7S的相同缓冲液作为对照组[10]。将所有的培养皿放在4 ℃环境中静置12 h后取出，恢复至室温。最后，将其置于（36±1）℃条件下，静置培养1 d，并准确测量抑菌圈大小。

1.3 数据分析

所有实验均平行进行3次，并将实验结果书写成“平均值±标准差”的形式。使用SPSS V20.0软件处理数据，进行ANOVA差异显著性分析（p＜0.05为差异显著）；采用Origin Version 8.1软件进行图表的制作。

2 结果与分析

2.1 酯化蛋白制备条件的确定

2.1.1 反应时间对酯化率的影响

由图3可知，不同蛋白质在相同反应时间内酯化率不同，SPI酯化率最高，11S和7S酯化率略低；但是，当不断延长反应时间时，这3种蛋白质的酯化率均先逐渐升高后趋于稳定。SPI酯化率由2 h时的（24.7±3.1）% 增加到10 h时 的（51.4±0.4）%后不再明显增加；与SPI相似，11S酯化率由2 h时的（20.8±0.8）%增加到10 h时的（42.1±0.2）%后不再明显增加；7S酯化率由2 h时的（18.3±1.8）%增加到8 h时的（36.9±0.2）%后不再明显增加。故这3种大豆蛋白与甲醇充分反应后，继续延长反应时间并不能提高蛋白质的酯化率。这主要是因为蛋白质中可以参与酯化反应的游离羧基数是有限的，无限延长反应时间对提高酯化程度无较大意义。因此，制备MSPI、M11S、M7S较为合适的反应时间分别为10 h、10 h、8 h。

图3 反应时间对蛋白质酯化率的影响图

2.1.2 盐酸浓度对酯化率的影响

如图4所示，当盐酸浓度从0.7 mol·L-1增加到3 mol·L-1时，SPI、11S和 7S 3种蛋白质的酯化率均先上升后下降，且这3种蛋白质的最高酯化率所对应的盐酸浓度均为1.5 mol·L-1。本实验结果与SITOHY等[5]使用的酯化蛋白制备条件相同。反应开始随着盐酸浓度的增加，蛋白质的酯化率显著增加，说明盐酸促进了羧基质子化，使蛋白质的酯化程度得到提高。当盐酸浓度达到3.0 mol·L-1时，发现蛋白质-甲醇-盐酸混合体系由微黄色混浊液变成粉红色，说明盐酸浓度过高，破坏了蛋白质的结构，体系发生了副反应，对羧基反应产生了不利的影响。WANG等[11]的研究结果也发现类似现象。因此，制备MSPI、M11S、M7S较为合适的盐酸浓度为1.5 mol·L-1。

图4 盐酸浓度对蛋白质酯化率的影响图

2.1.3 物料比对酯化率的影响

如图5所示，当蛋白质与甲醇的物料比为2%～5%时，SPI、11S和7S的酯化率无明显变化；但是当蛋白质与甲醇的物料比超过5%时，3种蛋白质的酯化率均有所降低。此结果表明，当物料比为2%～5%时，盐酸已将蛋白质的羧基充分质子化，蛋白质最大程度与甲醇反应生成酯键；继续增加蛋白质含量，可能会导致部分蛋白质的羧基没有发生质子化，未参与反应的游离羧基含量升高，最终蛋白质的酯化率下降。结合酯化蛋白产率的需求，物料比5%时可以制备更多的酯化蛋白，故制备MSPI、M11S、M7S较合适的蛋白质与甲醇物料比为5%（W/V）。

图5 物料比对蛋白质酯化率的影响图

综上，SPI和11S酯化改性的最佳条件为反应时间10 h、盐酸浓度1.5 mol·L-1、蛋白质与甲醇物料比5%（W/V）；7S酯化改性的最佳条件为反应时间8 h、盐酸浓度1.5 mol·L-1、蛋白质与甲醇物料比5%（W/V）。

2.2 红外光谱分析

如图6所示，所有蛋白样品在3 300 cm-1附近的明显宽峰是O-H和N-H的伸缩振动引起的；而2 960 cm-1附近的峰是CH2和CH3上的C-H拉伸振动引起的；1 630～1 670 cm-1附近的峰是C=O的伸缩振动（酰胺I带）引起的[12]；1 520～1 540 cm-1附近的峰是N-H键的变形振动和C-N的拉伸振动（酰胺II带）引起的[13-14]。对蛋白质进行酯化改性后，蛋白质上的羧基与甲醇的羟基进行反应会生成酯基。样品MSPI，M11S和M7S的酯基在1 750～1 730 cm-1和1 300～1 000 cm-1处有2个较强吸收带，分别代表C=O和C-O的拉伸振动[11]。比较天然蛋白和酯化蛋白的红外光图谱，发现所有酯化蛋白在1 733 cm-1处均出现C=O吸收带，而天然蛋白在此处无吸收带，表明对天然蛋白进行酯化改性成功，生成了酯化蛋白，类似的实验结果在WANG等[11]、MORAND等[15]、SALINAS等[16]的研究中也被报道。

图6 酯化蛋白的红外光谱图

2.3 酯化蛋白等电点（pI）分析

如图7所示，M11S在pH=9.0时的电位为零，说明M11S的等电点（pI）为pH=9.0；同理，MSPI和M7S的pI值分别为pH=10.3和pH=10.4；天然SPI、11S和 7S的 pI值 分 别 为 pH=4.5、pH=6.4和pH=4.8[1,3]，两者相比，酯化蛋白的等电点显著升高，且酯化改性后3种蛋白质的pI值大小顺序为M7S≈MSPI＞M11S。根据SITOHY等[5]观点，酯化蛋白比天然蛋白的等电点高，很可能是酯化改性封闭了蛋白质的游离羧基，使酯化蛋白与天然蛋白表面的电荷分布情况不同所致。由于11S蛋白结构致密，酯化程度略低，导致其等电点增幅低于M7S和MSPI，这与蛋白质的酯化率结果一致。

图7 不同pH时酯化蛋白溶液的Zeta-电位图

2.4 酯化蛋白抑菌性分析

实验结果显示，在pH=5.0的环境中，对照组对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌没有抑制效果；然而，在此pH下，酯化大豆蛋白对这两类细菌存在一定的抑菌性。如图8所示，随着酯化蛋白浓度不断增加，MSPI、M11S、M7S对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抑制效果均逐渐增强。当3种酯化蛋白浓度均为10 mg·mL-1时，MSPI、M11S、M7S对大肠杆菌的抑菌圈直径分别为（11.20±0.02）mm、（10.42±0.07）mm和（11.31±0.2）mm；对沙门氏菌的抑菌圈直径分别为（11.34±0.02）mm、（11.47±0.12）mm 和（11.90±0.22）mm；对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为（11.33±0.06）mm、（11.25±0.02）mm和（11.27±0.14）mm。而MSPI和M7S浓度为0.1 mg·mL-1时，就可以观察到抑菌圈；M11S则在1.0 mg·mL-1时，才可以观察到抑菌圈的出现。因此，MSPI、M11S、M7S出现抑菌效果的最小浓度分别为0.1 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1。

图8 酯化蛋白的抑菌性图

3 结论

酯化改性有利于提高SPI、11S、7S的等电点，改善蛋白质在酸性条件下的溶解度；同时，能够使蛋白质表面携带正电荷，通过静电作用来抑制微生物生长。本实验以蛋白质酯化率为指标，确定了制备MSPI和M11S两种蛋白质的最优条件：反应时间控制为10 h，盐酸浓度为1.5 mol·L-1，蛋白质与甲醇物料比为5%（W/V）；制备M7S的最优条件：反应时间控制为8 h，盐酸浓度为1.5 mol·L-1，蛋白质与甲醇物料比为5%（W/V）。在pH=5.0时，MSPI、M11S、M7S具有优良的抑菌效果，最小抑菌浓度分别为 0.1·mL-1、1.0·mL-1、0.1 mg·mL-1。本研究制备的酯化大豆蛋白等电点升高，改善了酸性条件大豆蛋白的溶解性，赋予了大豆蛋白抑菌性能，拓宽了大豆蛋白的应用范围，提高了大豆制品的附加值。