急性髓系白血病免疫表型分析及NPM1基因突变检测*

逄 婷，刘志伟，邹茂贤，叶志权，胡淑芬

广东省广州市番禺区中心医院检验科，广东广州 511400

急性髓系白血病(AML)是一组在临床及遗传学上均具有异质性的恶性血液系统疾病。免疫表型分析是判断肿瘤细胞来源、分化程度以及预后的重要手段，而开展白血病相关基因突变检测，则是对AML患者进行精确分级诊断、预后评估以及靶向治疗等的重要依据[1]。核仁磷酸蛋白1(NPM1)基因突变是成人AML中最常见的突变之一[2]。目前发现的该基因突变绝大多数是位于NPM1基因第12号外显子上的插入突变[3]。美国国立综合癌症网络指南将单独NPM1基因突变的正常核型AML患者列为预后良好组。为了探讨NPM1基因突变AML患者是否存在独特的临床及血液学特征，本研究回顾性分析了70例初诊AML患者NPM1基因突变的发生情况、免疫表型、临床表现和血液学特征，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年1月至2021年5月在本院就诊的70例初诊AML患者作为研究对象，其中男40例、女30例，年龄14～87岁、中位年龄58岁。所有患者均完成血液细胞形态学及流式细胞术等相关检查，并符合白血病诊断标准。按照法、美、英(FAB)协作组诊断分型标准将AML分为M1～M6型。

1.2方法

1.2.1血液细胞形态学及流式细胞术检查 征得患者知情同意，抽取骨髓及外周血标本制作涂片，涂片经瑞氏染色后，在Olympus显微镜下分类计数200个(骨髓片)及100个(血片)有核细胞，根据形态特点进行分类计数。利用4色荧光(荧光素分别为FITC、PE、APC、PerCP)免疫标记法进行免疫分型检测。所检测的髓系抗原有CD15、CD13、CD33、CD14、CD64、CD71、CD117、CD11b、MPO；T淋巴细胞抗原有CD3、CD8、CD4、CD2，CD7、CD5；B淋巴细胞抗原有CyCD79a、CD10、CD19、CD20，CD22；NK细胞抗原有CD56；其他非特异系列抗原有CD34、CD38、HLA-DR等。利用CD45/SSC设门分析原始或幼稚细胞群抗原表达特点，通常以比例≥20%为该抗原表达阳性，MPO≥10%为阳性。

1.2.2PCR检测NPM1基因突变 (1)基因组DNA提取。采用全自动核酸提取仪(Smart32)标准抽提法，严格按说明书要求提取骨髓细胞DNA，并置于-20 ℃冰箱保存备用。(2)NPM1基因突变检测。参照文献[4]设计NPM1基因第12外显子引物，并由北京六合华大基因科技有限公司合成，F：5′-TTAACTCTCTGGTGGTAGAATGAA-3′；R：5′-CAAGACTATTTGCCATTCCTAAC-3′。PCR总体系25 μL，包含模板DNA 4 μL、正反向引物各1.5 μL、Pre-Mix Taq 12.5 μL(TaKaRa)、Betaine 5.5 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共33个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物在含核酸染料的1%琼脂糖凝胶中进行电泳(110 V，10 min)，紫外灯下观察目的条带约为560 bp。产物用5′-AAAAGGACAGCCAGATATCA AC-3′测序引物进行直接测序(由广州天一辉远基因公司完成)，在测序引物后70～100 bp出现双峰的标本为NPM1基因突变阳性标本。

2 结 果

2.1AML患者免疫表型分析结果 70例AML患者FAB分型分别为M1型6例、M2型18例、M3型11例、M4型14例、M5型20例、M6型1例，其中，M5型AML发病率最高，占28.57%，其他依次为M2型(25.71%)、M4型(20.00%)、M3型(15.71%)、M1型(8.57%)、M6型(1.43%)。髓系抗原表达率由高到低依次为CD13(97.14%)、CD33(94.29%)、CD117(82.86%)、CD15(62.86%)、CD71(61.43%)、CD64(60.00%)、CD11b(31.43%)、CD14(8.57%)。非特异系列抗原表达率由高到低依次为CD38(100.00%)、HLA-DR(77.14%)、CD34(55.71%)。44例(62.86%)AML患者伴有淋巴细胞抗原表达，表达率由高到低依次为CD7(35.71%)、CD4(27.14%)、CD2(17.14%)、CD22(11.43%)、CD19(1.43%)，其中12例为T淋巴细胞抗原共表达(CD2与CD4共表达6例，CD2与CD7共表达3例，CD4与CD7共表达3例),7例为T、B淋巴细胞抗原混合表达(CD7与CD22混合表达3例，CD4、CD7与CD22混合表达2例，CD2与CD19混合表达1例，CD4与CD22混合表达1例)。各AML亚型均高表达CD38、CD13、CD33，而CD34及HLA-DR在M3型患者中的表达率最低，CD14仅在M4型和M5型中表达，见表1。

表1 70例AML患者各种抗原表达情况(n)

2.2NPM1基因突变分析 70例初诊AML患者直接测序后共13例(18.57%)检出NPM1基因突变，可见在测序开始后70～100 bp呈现双峰，57例未检出NPM1基因突变(图1A)。分析发现其中10例患者为A型突变(图1B)，表现为c.860_863处重复TCTG 4个碱基，导致NPM蛋白羧基(C)末端读码框移。1例患者为B型突变(图1C)，表现为c.863_864处插入CATG 4个碱基，2例患者为D型突变(图1D)，表现为c.863_864处插入CCTG 4个碱基。除M3型、M6型外，M1、M2、M4、M5型均有NPM1突变发生，该突变在各型患者中的发生率分别为M1型50.00%(3/6)、M2型11.11%(2/18)、M4型28.57%(4/14)、M5型20.00%(4/20)，差异均无统计学意义(P>0.05)。NPM1基因突变在非AML-M3的检出率为22.03%(13/59)。

注：A为无NPM1基因突变测序图；B为A型突变直接测序图；C为B型突变直接测序图；D为D型突变直接测序图。箭头示突变插入位点。

2.3不同NPM1基因突变患者血液学及免疫表型特点分析 70例患者按照NPM1基因突变检测结果分为NPM1阳性组(13例)和NPM1阴性组(57例)。NPM1阳性组AML患者初诊时白细胞计数(WBC)、血小板计数(PLT)、乳酸脱氢酶(LDH)及骨髓原始或幼稚细胞比例均高于NPM1阴性组，但差异均无统计学意义(P>0.05)。NPM1阳性组CD34阳性率(15.38%)低于NPM1阴性组(64.91%)，差异有统计学意义(P<0.05)，其余免疫表型及年龄、性别等差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 70例初诊AML患者血液学及免疫表型分析

组别nCD34+(n/n)CD117+(n/n)HLA-DR+(n/n)CD15+(n/n)CD64+(n/n)CD4+(n/n)CD56+(n/n)NPM1阳性组132/1310/139/136/136/135/136/13NPM1阴性组5737/5748/5745/5738/5736/5714/5715/57t/χ2/Z10.5240.0490.1501.1301.2750.4511.152P0.0010.8250.6990.2880.2590.5020.283

3 讨 论

急性白血病(AL)是由于造血干或祖细胞突变导致的一组具有异质性的恶性血液系统疾病。FAB分型是国际上较为统一的诊断AL的早期分型方法。血液细胞形态学与流式细胞术联合应用，可以明显提升AL的诊断准确性。本研究70例AML患者中，最常表达的髓系抗原为CD13(97.14%)和CD33(94.29%)，是鉴别急性淋巴细胞白血病(ALL)和AML的重要免疫标志，其余髓系抗原表达率由高到低依次为CD117、CD15、CD71、CD64、CD11b、CD14。44例AML患者伴有淋巴细胞抗原表达，其中部分病例存在T淋巴细胞抗原共表达或T、B淋巴细胞抗原混合表达的情况。非特异系列抗原在本研究AML患者中的表达率依次为CD38(100.00%)、HLA-DR(77.14%)、CD34(55.71%)。在M3型患者中CD34、HLA-DR及CD11b的表达率较低，与文献[5]报道基本一致。另外，11例M3型患者(PML-RARa融合基因阳性)均未检测到NPM1基因突变，说明该基因突变与融合基因之间无重叠现象[6]。

人类NPM1基因位于5q35上，编码由294个氨基酸组成的蛋白质。NPM1基因突变主要发生于第12号外显子，突变具有遗传异质性，其中以A型突变最为常见。本研究70例初诊AML患者直接测序后共检出13例NPM1基因突变阳性者，表现在测序开始后70～100 bp呈现双峰，其中10例患者为A型突变(76.92%)，1例患者为B型突变，2例患者为D型突变。上述突变均为移码突变，可造成NPM1羧基末端氨基酸序列发生变化，原来的7个氨基酸残基被11个残基所替代(替代后为CLAVEEVSLRK)。这种突变影响了羧基末端核仁定位信号(NoLS)，并导致NPM1从细胞核转移到细胞质[7]，AML的发生可能与在胞质中异常聚集的NPM1相关联。VAN DER LEE等[8]认为NPM1突变后产生的NPM1羧基末端11个氨基酸残基可以作为一种免疫治疗的新抗原，通过证实一种肽(HLA-A*02:01结合CLAVEEVSL)可通过T细胞受体基因转移有效靶向AML，表明突变NPM1有望成为相关AML的免疫治疗新靶点。

本研究显示，NPM1阳性组AML患者初诊时年龄偏大，女性比例较高，WBC、PLT、LDH及骨髓原始或幼稚细胞比例高于NPM1阴性组，但差异无统计学意义(P>0.05)。免疫表型分析显示，NPM1阳性组CD34阳性率低于NPM1阴性组(P<0.05)，其余免疫表型差异无统计学意义(P>0.05)。这可能与AML患者样本量偏少及可能存在其他基因突变[如FMS样的酪氨酸激酶3内部串联重复序列(FLT3-ITD)、DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)等]的影响有关。据文献[9]报道，NPM1突变常与DNMT3A、FLT3-ITD突变共同发生，它们协同作用而导致白血病的发生。使用变异等位基因频率来推断它们在白血病发生过程中的顺序，结果表明DNMT3A基因突变可能在造血干细胞中首先发生，然后是髓系祖细胞中的NPM1基因突变，第三是FLT3基因突变。大量研究证明，AML患者不同的基因突变可引起相似或不同的免疫表型及血液学特征[10]。

70例初诊AML患者中，除M3、M6型外，M1、M2、M4、M5型均有NPM1基因突变发生，其中M1型突变率最高(50.00%)，其余依次为M4、M5、M2型。国内外部分研究结果是以M4型或M5型突变率较高[3,11]，这与本研究结果不同，但部分国内研究结果[12]与本研究结果一致。70例AML患者中NPM1基因突变检出率为18.57%，低于文献[3,13-14]的报道，而高于SU等[15]的报道；NPM1基因突变在非AML-M3的检出率为22.03%(13/59)，与相关报道亦有不同[16-17]。上述问题可能的原因：患者组成及种群差异；收集的NPM1基因突变阳性初诊AML患者样本不多。此外，据文献[9]报道，NPM1基因在AML发生、发展过程中表达较稳定，该基因突变可在完全缓解后转阴，而在疾病复发时重新被检出，提示该基因突变检测可作为AML疗效判断以及复发监测的一种有效手段。

综上所述，NPM1突变是AML患者常见的一种分子学异常，突变发生率较高，CD34阳性率降低。免疫表型检测可提高AML诊断的准确性。