不同加工方法与贮存时间对覆盆子含量测定指标的影响

何佳，周越美，赵智慧，谭春梅，张文婷

(1.浙江中医药大学药学院，杭州 310053；2.浙江天冉中药饮片有限公司，绍兴 311800 3.浙江省食品药品检验研究院中药所，杭州 310052；4.国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，杭州 310052)

覆盆子为蔷薇科植物华东覆盆子(RubuschingiiHu)的干燥果实，具有益肾固精缩尿、养肝明目的功效[1]。《中华人民共和国药典》自2015年版始，新增了覆盆子含量测定项，为采用高效液相色谱(HPLC)法测定鞣花酸和山柰酚-3-O-芸香糖苷含量。鞣花酸一般以鞣花单宁、鞣花酸糖苷以及游离鞣花酸3种形式存在，其中鞣花单宁属于水解单宁[2-3]，加热回流过程可使鞣花单宁转化为游离鞣花酸[4]，《中华人民共和国药典》2020年版覆盆子项下的鞣花酸实为游离鞣花酸。《中华人民共和国药典》2020年版对覆盆子产地加工方法的规定为除去梗和叶，置沸水中略烫或略蒸[1]。然而通过实地调研发现，在实际生产应用中，药农在覆盆子采收后往往未经沸水浸煮而是采用直接晒干的方法对覆盆子进行产地加工。此外，当年新产覆盆子鞣花酸指标易低于限度，而通过贮藏后可提高其含量。对于不同的产地加工方法、储存条件与时间长短等因素对覆盆子的质量控制指标是否会产生影响，目前研究中鲜有报道。

本实验对《中华人民共和国药典》2020年版覆盆子含量测定项下鞣花酸与山柰酚-3-O-芸香糖苷的供试品溶液制备方法与色谱条件进行了优化，采用70%甲醇超声提取75 min的方法制备供试品溶液，采用HPLC-波长切换法，以乙腈-0.2%磷酸作为流动相梯度洗脱，经方法学验证，该方法稳定可靠，简便可行。并采用优化后的方法分别测定不同加工方法、加速稳定实验条件下不同贮藏时间的覆盆子样品中指标成分的含量，分析指标成分的影响因素与变化规律，以期为覆盆子的质量评价与控制提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司，配备DAD检测器)；XPE205电子天平(瑞士Mettler Toledo公司，感量：0.1 mg)。Milli-Q advantage A10 超纯水仪(美国millipore SAS 公司)；Minispin12000转离心机(德国Eppendorf公司)；ELMASONIC P 超声波清洗器(ELMA公司)；恒温水浴锅(德国优莱博公司)；UF55plus电热恒温干燥箱(德国MEMMERT公司)；冷冻混合球磨仪(德国RETSCH公司)；蒸锅；电热板。

1.2对照品与试剂 鞣花酸(批号：111959-201903，含量：88.8%)、山柰酚-3-O-芸香糖(批号：112007-201602，含量：90.8%)均购自中国食品药品检定研究院。甲醇、磷酸为分析纯(杭州化学试剂有限公司)，流动相用乙腈为色谱纯(MERCK公司)，水为Millipore超纯水。

1.3样品 本实验收集了10批的覆盆子饮片(S1-S10)用于含量测定，不同加工方法实验用样品为采集自浙江诸暨的覆盆子鲜品，采集后采用不同的初加工方法自行加工制备成实验用样品(J1-J6)。不同贮存时间实验用样品是将自行加工后的直接晒干(Z1-Z4)、直接烘干(Z5-Z8)、蒸后晒干(Z9-Z12)3种加工处理的覆盆子放入恒温恒湿箱，在(40±2) ℃、相对湿度(75±5)%条件下进行加速稳定实验，在实验期间第0，1，2，3个月末取样检测。其中药材的包装与封装条件应与拟上市包装一致。样品具体信息见表1，样品经浙江省食品药品检验研究院郭增喜主任中药师鉴定为蔷薇科植物华东覆盆子(RubuschingiiHu) 的干燥果实。

表1 覆盆子样品信息 Tab.1 Information of Rubus chingii Hu samples

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：Besil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)(梯度洗脱0～55 min，8%～25% A)；检测波长：0～38 min，254 nm，38～55 min，344 nm。柱温为25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；对照品、供试品均进样10 μL。供试品溶液与对照溶液HPLC图谱见图1。

1.鞣花酸；2.山柰酚-3-O-芸香糖苷。图1 混合对照品(A)和供试品溶液(B)HPLC图 1.ellagic acid；2.kaophenol-3-O-rutin.Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A) and test solution(B)

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液的制备 分别取鞣花酸、山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每毫升含鞣花酸9.88 μg、山柰酚-3-O-芸香糖苷1.91 μg的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备 精密称取覆盆子粉末约0.50 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，超声处理(功率400 W，频率50 kHz)75 min，冷却，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3线性关系考察 将“2.2.1”项下的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，以1，2，4，8，16，24 μL的进样体积依次进样；以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标作标准曲线图，结果鞣花酸、山柰酚-3-O-芸香糖苷在进样量分别为9.88～273.12 ng、1.91～45.84 ng范围内均有良好的线性关系，具体结果见表2。

表2 覆盆子2种指标成分线性范围与回归方程 Tab.2 Linear range and regression equation of two index components in Rubus chingii Hu

2.4精密度考察 精密吸取混合对照溶液连续进样测定6 次，以各色谱峰的峰面积计算鞣花酸、山柰酚-3-O-芸香糖苷的峰面积RSD分别为0.3%，1.5%，表明仪器精密度良好。

2.5重复性考察 取同一覆盆子样品(S3)，按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积并计算含量，鞣花酸、山柰酚-3-O-芸香糖苷6次测定的RSD分别为2.2%，1.3%，表明方法的重复性较好。

2.6溶液稳定性考察 取同一覆盆子样品(S3)，按“2.2.2”项下方法制备供试品1份，分别在制备0，2，4，6，12，24 h后按“2.1”项下色谱条件进样分析，测定峰面积，结果鞣花酸、山柰酚-3-O-芸香糖苷的峰面积RSD分别为0.5%，1.4%。结果表明，供试品溶液在室温下放置24 h稳定。

2.7准确性(回收率)考察 精密称取已知含量样品(S3)约0.25 g，按“2.2.2”项下方法2种供试品各称取6份，分别精密加入对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件色谱条件测定并计算回收率，结果见表3，鞣花酸、山柰酚-3-O-芸香糖苷的平均回收率分别为104.27%，96.81%，RSD分别为2.6%，1.7%，符合《中华人民共和国药典》2020年版四部药品质量标准分析方法验证指导原则的要求，说明本法准确度良好。

表3 覆盆子中2个指标成分加样回收率 Tab.3 Recovery rate of two index components in Rubus chingii Hu with sample addition n=6

2.8样品的测定 按“2.2.2”项下的方法制备样品，按“2.1”项下的色谱条件测定，计算各样品中鞣花酸与山柰酚-3-O-芸香糖苷的含量，结果见表4。

表4 覆盆子样品含量测定结果 Tab.4 Content determination results of Rubus chingii Hu samples mg·g-1，n=2

3 讨论

3.1不同加工方法对覆盆子2种指标成分的影响 《中华人民共和国药典》2020年版对覆盆子产地加工方法的规定为除去梗和叶，置沸水中略烫或略蒸。产地加工的主要目的是迅速脱水、杀酶保苷，恰当的漂烫处理可破坏酶的活性[5]。本实验采用覆盆子实际使用过程中使用到的6种加工方法对采集到的覆盆子鲜品进行了初加工，结果发现，采用直接晒干加工得到的覆盆子样品，其鞣花酸的含量远远高出其他加工方式得到的样品。由于鞣花单宁在酸、碱或酶的作用下可水解生成游离鞣花酸，直接晒干的加工方式由于温度较低，无法将植物内源酶抑制，因此造成直接晒干样品鞣花酸含量远高于其他样品，其原因可能是内源酶对鞣花单宁作用。比较2种杀青方法得到的样品，沸水杀青后得到的样品鞣花酸含量较蒸汽杀青后样品低，可能是由于在杀青过程中游离鞣花酸溶于沸水。而采用相同杀青方法杀青后的样品晒干或烘干2种干燥方式则对指标含量的影响较小。黄酮类山柰酚-3-O-芸香糖苷较为稳定，受加工方法的影响较小，6种加工方法得到的样品中该成分的含量相差较小，未经杀青处理而采用直接晒干与直接烘干加工而成的样品其含量略高于杀青后的样品，可能是由于杀青过程对山柰酚-3-O-芸香糖苷造成了一定的损失。综合考虑，产地加工方式中，以《中华人民共和国药典》2020年版方法蒸汽杀青后晒干或烘干来进行覆盆子的产地加工较为合理。

3.2不同储存时间对覆盆子2种指标成分的影响 覆盆子在我国分布较广，多省多地均有种植，前期调研发现当年新产覆盆子鞣花酸指标易低于限度，而通过贮藏后可提高其含量。为探索覆盆子贮藏过程中成分的变化，通过对3种代表性的覆盆子初加工样品进行加速稳定性实验模拟贮藏过程对覆盆子指标成分的影响。结果发现，3种加工方法得到的覆盆子样品中鞣花酸的含量均随着贮存时间的延长而增加，山柰酚-3-O-芸香糖苷的含量则随着贮存时间的延长而减少。将2个指标成分的含量数据导入SPSS 18.0版软件中进行相关性分析后发现储存时间与鞣花酸的含量呈极显著正相关(r=0.908，P<0.01)，储存时间与山柰酚-3-O-芸香糖苷含量呈显著负相关(r=-0.583，P<0.05)，两指标成分含量直接相关性不显著。不同加工方法得到的样品储存3个月较0月相比鞣花酸的含量变化：直接晒干样品3个月样品鞣花酸含量是0月样品的2.75倍；直接烘干样品是0月样品的3.10倍；蒸汽杀青后晒干样品是0月样品的2.48倍，山柰酚-3-O-芸香糖苷的含量变化：直接晒干样品储存3个月后含量为0月的75.62%；直接烘干样品为82.23%；蒸汽杀青后晒干样品为85.39%。杀青过的样品两指标成分的变化较未杀青样品缓慢。

3.3提取方法的优化 本实验考察了回流提取、超声提取、回流后正丁醇萃取、超声后正丁醇萃取4种提取方法。4种提取方法得到的色谱图均能呈现良好的分离。《中华人民共和国药典》2020年版中对于鞣花酸的提取方法采用的是加热回流的提取方法，目前已有文献报道当温度达到80 ℃时，已有鞣花单宁可水解生成鞣花酸[6]，在前期实验中笔者发现回流提取鞣花酸的含量为超声提取的1.7倍，且随着回流时间的增加，鞣花酸的含量在不断增加，提示鞣花单宁在加热回流的过程中会受热水解生成游离鞣花酸，加热回流的方法会影响鞣花酸提取的准确性，而4种提取方法对于山柰酚-3-O-芸香糖苷含量的影响较小，综合考虑后采用直接超声的方法提取2种成分最为合理、简便可行。对提取溶剂进行考察时，分别采用60%，70%，80%甲醇3种溶剂进行提取，结果发现70%甲醇对2种有效成分的提取率最高，故选择70%甲醇作为提取溶剂。对超声时间进行考察时，选择了45，60，75，90 min进行考察，结果发现75 min时2种成分已经基本提取完全，故选择75 min作为提取时间。

3.4色谱条件的优化 由于鞣花酸与山柰酚-3-O-芸香糖苷的最大吸收波长分别为254及344 nm，故采用HPLC-波长切换的方法同时检测2种成分。《中华人民共和国药典》2020年版中对于2种成分均采用乙腈-0.2%磷酸(15：85)进行等度洗脱，但实验发现该梯度下山柰酚-3-O-芸香糖苷峰形较差，而采用乙腈-0.2%磷酸进行梯度洗脱时，峰形得到改善，且可与周围杂质峰达到基线分离。

3.5山柰酚-3-O-芸香糖苷专属性研究 本实验收集到覆盆子的伪品山莓、蓬蘽、软覆盆子、甜叶悬钩子，采用建立的含量测定方法对覆盆子正品及4种伪品进行含量测定后发现，4种伪品均不含有山柰酚-3-O-芸香糖苷，结果表明，山柰酚-3-O-芸香糖苷具有专属性，可有效鉴别覆盆子与其代表性混伪品。在对10批覆盆子饮片进行含量测定后，结果显示S7、S8、S9等3批样品含量均低于《中华人民共和国药典》2020年版规定限度，进一步对这3批样品的性状进行研究后发现，S7、S8批样品为过成熟样品，《中华人民共和国药典》2020年版规定覆盆子应在由绿变绿黄时进行采收，目前已有文献报道，山柰酚-3-O-芸香糖苷的含量会随着覆盆子成熟度的变化而显著降低[7]，S9号样品经鉴定后为掺有一定比例山莓的样品。因此，该将指标作为特征性鉴别指标并对其含量进行控制对于覆盆子的质量评价较为合理。

覆盆子为药食两用植物，市场需求量较大，但质量参差不齐。对于覆盆子的质量控制，《中华人民共和国药典》2020年版覆盆子项下的2个指标成分中，山柰酚-3-O-芸香糖苷为覆盆子中主要的黄酮类成分，该成分具备专属性，可以有效鉴别覆盆子及其代表性混伪品，且该成分含量受不同加工方法的影响较小，会随着贮存时间的增加而降低，因此对其限量进行控制对于覆盆子的质量控制与评价较为合理。而鞣花酸成分实为游离鞣花酸，该成分受提取方法、产地加工方法、贮存时间的影响均较大，因此该成分不能够真实地评价覆盆子的质量优劣，建议对该指标进行修订。