BMAP-28对乳腺癌Bcap37细胞的抗肿瘤活性研究

李昂 王顺 刘桃源 衣同辉 李淑艳 潘洪明

【摘要】 目的：研究BMAP-28对乳腺癌Bcap37细胞增殖及凋亡的影响。方法：体外培养Bcap37细胞，设置对照组（BMAP-28浓度为0 μg/mL）和实验组（BMAP-28浓度分别为20、40、60、80 μg/mL）。CCK-8实验检测Bcap37细胞的增殖情况;DAPI染色观察细胞凋亡形态学变化;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：CCK-8实验测得BMAP-28对Bcap37细胞的增殖具有抑制作用，BMAP-28的IC50=49.19 μg/mL。DAPI染色可见随着BMAP-28浓度的增加，细胞凋亡数量增加，凋亡形态明显。流式细胞术显示细胞凋亡率逐渐增高，趋势和DAPI染色结果一致（P<0.01）。结论：BMAP-28能显著抑制乳腺癌Bcap37细胞的增殖，促进癌细胞的凋亡，有望成为临床乳腺癌治疗的新型抗癌药物。

【关键词】 BMAP-28 乳腺癌 增殖 凋亡

Study on Anti-tumor Activity of BMAP-28 on Breast Cancer Bcap37 Cells/LI Ang， WANG Shun， LIU Taoyuan， YI Tonghui， LI Shuyan， PAN Hongming. //Medical Innovation of China， 2022， 19（10）： 0-016

[Abstract] Objective： To study the effects of BMAP-28 on the proliferation and apoptosis of breast cancer Bcap37 cells. Method： Bcap37 cells were cultured in vitro， the control group （BMAP-28 concentration was 0 μg/mL）

and the experimental group （BMAP-28 concentrations were 20， 40， 60， 80 μg/mL） were set up. CCK-8 assay was used to detect the cell proliferation of breast cancer Bcap37 cells， DAPI staining was used to observe the morphological changes of cell apoptosis， flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of cells. Result： CCK-8

assay showed that BMAP-28 can inhibit the proliferation of breast cancer Bcap37 cells， IC50=49.19 μg/mL. DAPI staining showed that with the increase of BMAP-28 concentration， the number of cell apoptosis increased， and the apoptotic morphology was obvious. Flow cytometry showed that the rate of cell apoptosis increased and the trend was consistent with the result of DAPI staining （P<0.01）. Conclusion： BMAP-28 can significantly inhibit the proliferation of breast cancer Bcap37 cells and promote the apoptosis of cancer cells， which is hopefully to be a new type of anticancer agents for clinical breast cancer treatment.

[Key words] BMAP-28 Breast cancer Proliferation Apoptosis

First-authors address： School of Medical Technology， Qiqihar Medical University， Qiqihar 161006， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.10.004

癌癥是全球范围最受关注的公共卫生问题之一，严重危害人类生命健康。国际癌症研究机构（international agency for research on cancer，IARC）最新发布的癌症统计数据显示，2020年全球新发癌症病例1 930万例，死亡1 000万例。而在女性当中，乳腺癌（占新发病例的11.7%）首次超过肺癌（11.4%），成为女性癌症中最常见的类型[1]。一些常规的化疗药物不仅利用率低，癌症复发率高，且常伴有细胞耐药性[2]。

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是少于50个氨基酸组成的小分子短肽，通常带正电荷，且呈两亲性[3]。它是机体先天免疫系统中的重要组成部分，能杀灭细菌、真菌、寄生虫及病毒等[4]。近年来人们发现越来越多的AMPs同时具有抗肿瘤活性[5-6]。BMAP-28是牛中性粒细胞中发现的一种牛骨髓抗菌肽，属于Cathelicidin家族，于1996年首次被发现[7]。该肽由28个氨基酸组成，其N-末端呈两亲性-螺旋构象（残基1-18），C-末端是疏水尾部（残基19-27），带有7个正电荷[8]。早期研究报道BMAP-28具有广谱抗菌活性，能够抑制多种革兰阴性、革兰阳性细菌及其他耐药菌[9-10]，后续的研究发现BMAP-28还具有不同程度的抗肿瘤活性。本课题通过研究BMAP-28对乳腺癌Bcap37细胞增殖和凋亡的影响，为癌症的临床研究及新型抗乳腺癌药物的研发提供理论基础。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 研究起止时间：2021年3-8月。乳腺癌细胞系Bcap37由大连理工大学惠赠;BMAP-28购自安徽国肽生物有限公司;DMEM-H（美国Gibco公司）;胎牛血清（美国Clark公司）;CCK-8试剂盒（南京碧云天生物技术有限公司）;DAPI染色液（北京索莱宝有限公司）;Annexin V-FITC/PI试剂盒（北京博奥森技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 Bcap37细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。当细胞融合度达80%～90%时，PBS冲洗后用0.25%胰酶消化，再用配制好的培养基吹打并制备成单细胞悬液，收集细胞用于后续实验。

1.2.2 CCK-8实验测定细胞增殖能力 收集对数生长期的Bcap37细胞，按5×103个/孔的密度将细胞接种于96孔板。设置对照组（BMAP-28浓度0 μg/mL）、实验组（BMAP-28终浓度分别为20、40、60、80 μg/mL），每组设置5个复孔。每孔加入100 μL相应浓度的BMAP-28，对照组加入相同体积DMEM-H培养基。继续培养24、48 h后，按照CCK-8试剂盒说明，每孔加入10 μL的CCK-8试剂，孵育2 h后测定450 nm波长下的吸光度值。每组不同浓度取3个复孔的OD值计算细胞活力。计算半数抑制浓度（IC50），并筛选最佳作用时间。

1.2.3 DAPI实验观察细胞凋亡情况 细胞处理及分组方式同1.2.2。取6孔板以5×104个/孔密度接种细胞，每组设置3个复孔。BMAP-28作用24 h后用PSB冲洗2次，每孔加入适量4%多聚甲醛溶液，置于-20 ℃冰箱固定20 min。弃去固定液，用PBS冲洗2次后，每孔加入适量DAPI染色工作液，室温下避光孵育10 min。PBS冲洗2～3次后，荧光显微镜下拍照观察各组细胞形态变化。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 细胞处理及分组方式同1.2.2。细胞按1×105个/孔接种于6孔板。BMAP-28作用24 h后，离心收集各组细胞。按照试剂盒操作流程进行Annexin V-FITC和PI染色，1 h内用流式细胞仪测定各组中正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞的比例。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism 8.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCK-8实验测定细胞增殖情况 BMAP-28作用24、48 h后，对Bcap37细胞增殖的抑制趋势均增强，且随着浓度的增加，细胞活力逐渐降低。实验组不同浓度24、48 h细胞活力与对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。应用GraphPad Prism 8.0绘制24、48 h时BMAP-28浓度抑制曲线（图1）。采用非线性回归分析，计算出BMAP-28作用Bcap37细胞24 h的IC50=49.19 μg/mL。

2.2 DAPI实验观察细胞形态变化 与对照组相比，不同浓度的BMAP-28作用24 h后，可见细胞边界逐渐收缩变圆，细胞形态变得模糊形成碎片，细胞核大小不一，核内部分染色质出现断裂或皱缩形成团块。且随药物浓度的增加，细胞数量减少，凋亡细胞增多，见图2。

2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 对照组（0 μg/mL）、实验组（20、40、60、80μg/mL）细胞凋亡率依次为（3.983±1.556）%、（11.423±1.776）%、（31.767±5.159）%、（37.400±2.651）%、（44.833±4.826）%，随着BMAP-28浓度的增高，凋亡细胞数量随之增多，趋势和DAPI染色结果一致，实验组不同浓度（20、40、60、80μg/mL）细胞凋亡率与对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.01）。从20 μg/mL开始，BMAP-28对Bcap37细胞杀伤作用逐渐增大，见图3。

3 讨论

目前乳腺癌已超越肺癌，成为当今全球第一大癌症类型[11]。抗肿瘤药物的开发一直是癌症治疗的重点课题，分子靶向治疗与免疫疗法在癌症治疗中取得一定成效，但不良反应及细胞耐药性问题仍然难以解决[12-13]。抗菌肽由于其分子量小、易于人工合成、不易产生耐药性等特点受到广泛关注[14]。对BMAP-28早期的研究主要集中在抗细菌、真菌及抗病毒活性。如BMAP-28能抑制多杀性巴氏杆菌（P.Multocida）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）及牛疱疹病毒1型（BoHV-1）和5型（BoHV-5）等病原体的生长。随着研究的深入，发现BMAP-28还对淋巴细胞瘤、甲状腺癌等肿瘤细胞具有抑制作用[9，15-16]。

无限增殖是恶性肿瘤最基本的生物特征之一，也是引起癌症患者死亡的根本原因[17]。本研究通过CCK-8实验证明，随着BMAP-28浓度的增加，Bcap37细胞存活率逐渐减小，说明BMAP-28具有抑制乳腺癌细胞增殖的作用。凋亡是细胞生理性死亡的过程，而肿瘤细胞由于调控机制等发生改变，往往能够逃避凋亡机制，获得无限增殖的能力[18]。因此促使肿瘤细胞发生凋亡，是一些新型抗癌药物研究的重要方向之一。细胞凋亡的完整实现涉及广泛的蛋白质和信号转导的相互作用，以及一系列信号通路的级联作用[19]。Caspase-3和Caspase-9是早期细胞凋亡细胞的标志。前期已有学者证明BMAP-28能激活甲状腺癌TT细胞Caspase-3和Caspase-9途徑，其蛋白和mRNA水平表达量均显著增加，标志着凋亡程序的启动[16]。另外，BMAP-28还可以诱导线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放导致线粒体功能紊乱，并促使细胞色素C（Cyt-C）的释放诱导细胞凋亡[20]。本研究发现，经DAPI染色后可见Bcap37细胞边界逐渐收缩变圆，形态变得模糊形成碎片，细胞核大小不一，核内部分染色质断裂或皱缩形成团块，提示BMAP-28能够促进Bcap37细胞的凋亡。流式细胞术实验也证实BMAP-28促进了Bcap37细胞发生凋亡，并呈现明显的剂量效应（P<0.01）。

综上所述，BMAP-28能显著抑制Bcap37细胞的增殖，并促进其凋亡，然而其分子机制尚不清楚，将在下一步的研究中继续探讨。

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（收稿日期：2021-08-17） （本文編辑：程旭然）