扁平苔藓患者皮损组织中miR-203及IL-22、IL-8的表达及其意义

(青岛大学附属医院皮肤科，山东 青岛 266003)

扁平苔藓(lichen planus, LP)是一种主要累及皮肤、黏膜的慢性炎性和免疫性疾病。LP典型皮肤损害表现为多角形紫红色扁平丘疹、斑块，上有白色网纹(Wickham纹)。目前多数学者认为细胞介导的免疫反应在LP的发病中发挥重要作用，但确切病因和发病机制尚不清楚[1-2]。miRNA作为一类小型内源性非编码RNA，在调节皮肤炎症、角质形成细胞增殖及免疫系统的分化等方面发挥重要作用[3-4]。miRNA可通过靶向调控mRNA的降解或翻译来动态调节编码蛋白基因的表达[5-6]。miR-203是miRNAs家族中重要成员，以往研究显示，皮肤LP(CLP)患者皮损组织中miR-203呈低表达，但在口腔LP(OLP)黏膜组织和唾液中miR-203却是呈高表达[7-9]。经双荧光素酶报告基因系统证实，miR-203是IL-22和IL-8的靶标miRNA，而IL-22和IL-8是机体炎性反应的重要递质[8，10]，但miR-203靶向调节IL-22、IL-8是否在CLP的发病机制中发挥作用尚不清楚。本研究通过检测CLP患者皮损组织和正常皮肤组织中miR-203及IL-22、IL-8的表达情况，探讨其在CLP发病中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料来源

选取 2019年5月—2020年5月我院皮肤科就诊的40例CLP患者的皮损组织样本(CLP组)。纳入标准：①临床表现典型并经病理组织学确诊；②近3个月未使用过免疫抑制剂或糖皮质激素治疗；③非孕期及哺乳期。同时选取我院同期于美容外科行美容手术切除的40例正常健康者皮肤样本作为对照(对照组)。CLP组患者男22例，女18例；年龄25～64岁，平均(46.43±11.53)岁。对照组男19例，女21例；年龄19～61岁，平均(43.30±12.98)岁。两组年龄、性别和取材部位方面差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 试剂及仪器

Mir-XTMmiRNA FirstStrand Synthesis and TB Green试剂盒、TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒、ELISA试剂盒(日本TaKaRa公司)，LightCycler 480仪(瑞士Roche 公司)。

1.3 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测皮肤组织中miR-203的表达

采用RNAiso plus试剂(日本TaKaRa公司)提取每一皮肤组织标本总RNA，采用紫外分光光度仪测定总RNA浓度与纯度，选取A260/A280在1.8～2.0的RNA，采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。采用Mir-XTMmiRNA FirstStrand Synthesis and TB Green试剂盒进行反转录反应。取组织总RNA 3.75 μL，mRQBuffer(2X) 5 μL，mRQ Enzyme 1.25 μL，反应体系共10 μL。然后进行PCR反应：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min终止反应。用TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒在LightCycler 480仪上进行miR-203检测。RT-qPCR反应中miR-203引物(F：5′-GTGAAATGTTTAGGACCACTAG-3′，R：5′-GTATCAACGCAGAGTACTTT-3′)；U6引物(F：5′-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3′，R：5′-TGGAACGCTTACCGAATTTGCG-3′)

1.4 酶联免疫吸附(ELISA)法检测皮肤组织中IL-22和IL-8的表达

使用ELISA试剂盒检测两组皮肤组织样本中IL-22及IL-8的表达水平，检测流程严格按照试剂盒说明书进行操作，使用酶标仪在波长450 nm处测定各孔吸光度(A)值，制作标准曲线，根据样品吸光度值，计算样本中IL-22及IL-8的表达水平。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 两组皮肤组织中miR-203及IL-22、IL-8的表达水平比较

CLP组皮肤组织中miR-203、IL-22、IL-8表达水平分别为1.27±0.74、24.78±3.93、24.16±2.99，对照组分别为1.60±0.74、23.01±3.03、22.91±2.43，CLP组皮肤组织中miR-203的表达水平明显低于对照组(t=2.013，P<0.05)，IL-22和IL-8表达水平显著高于对照组(t=-2.258、-2.048,P<0.05)。

2.2 CLP组皮肤组织中miR-203、IL-22以及IL-8表达水平间的相关性分析

Spearman相关分析显示，CLP组皮肤组织中miR-203基因表达水平与IL-22、IL-8表达水平均呈显著负相关(r=-0.348、-0.361，P<0.05)，IL-22与IL-8表达水平呈显著正相关(r=0.422，P<0.05)。见图1。

3 讨 论

异常表达的miRNAs可导致机体炎性细胞因子的持续性分泌，引发或加重机体的自身免疫性疾病[11]。miR-203被认为是皮肤和角质形成细胞的特异性miRNA，与皮肤中常见的慢性炎症性疾病有关，在许多炎症性疾病如银屑病、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮患者的外周血及组织中均异常表

A、B分别为miR-203与IL-22、IL-8表达水平的相关性，C：IL-22与IL-8表达水平的相关性

图1 CLP组皮肤组织中miR-203、IL-22及IL-8表达水平之间的相关性分析

Fig.1CorrelationbetweentheexpressionlevelsofmiR-203,IL-22,andIL-8inskintissueintheCLPgroup

达，可以通过作用于特定靶基因参与调控某些疾病的炎症反应[12-16]。在银屑病皮损组织中，miR-203上调可以抑制靶蛋白细胞因子信号通路抑制因子3(SOCS-3)的表达，激活信号传导与转录激活因子3(STAT3)信号通路，引起炎性细胞浸润[17-18]。XU等[19]研究表明，miR-203通过对靶蛋白IL-1受体相关激酶4(IRAK4)负调控进而抑制NF-κB信号的激活，发挥抗炎作用。本研究结果显示，CLP组皮损组织中miR-203的表达水平显著低于对照组，提示低表达的miR-203可能通过作用于靶蛋白参与CLP的炎症过程。SHEN等[8]研究发现，miR-203在OLP组织中呈现高表达，分析原因可能为，CLP和OLP组织结构不尽相同，所处的微环境亦不相同，与皮肤相比，口腔黏膜暴露于来自食物及不同于皮肤的细菌、病毒或真菌等的微生物环境中；此外，免疫荧光研究显示，在CLP棘层和颗粒层中观察到了LP特异抗原(LPSA)[20-21]。而OLP患者以及患有其他皮肤病的患者的棘层和颗粒层中却无此物质。这些抗原可能会干扰免疫反应，进而导致同一种miRNA在不同组织细胞中的表达出现完全相反的结果。

目前的生物信息学研究表明，IL-22和IL-8均是miR-203的靶蛋白。IL-22主要由固有免疫细胞以及适应性免疫细胞如Th1、Th17、Th22细胞产生[22]。在皮肤组织中IL-22主要作用于角质形成细胞[23]，一方面，IL-22可以促进角质形成细胞增殖，诱导其产生抗炎因子，发挥保护作用。另外，IL-22还可以诱导多种炎症递质的表达，进而参与并放大炎症反应[24-25]。近年来，IL-22在LP发病中的作用成为研究热点。DOMINGUES等[26]研究发现，激活Toll样受体7/8(TLR7/8)或葡萄球菌肠毒素B(SEB)可以诱导LP患者的促炎性CD8+IL-22+T细胞数量增加。CHEN等[27]发现，IL-22和IL-23在CLP和OLP黏膜组织中均呈现高表达，并且OLP黏膜组织中IL-22和IL-23表达水平显著高于CLP。IL-22是IL-23的下游效应细胞因子。IL-22可以由Th22细胞以IL-23依赖的方式表达，在LP中介导T淋巴细胞的浸润和上皮细胞的损伤。本研究的结果显示，CLP组皮肤损伤组织中IL-22的表达水平较对照组明显上调，提示其可能参与了CLP的致病过程。且因IL-22是Th22细胞的标志性细胞因子，提示CLP的致病过程可能与Th22细胞介导的免疫反应有关[28]。

IL-8是Th1细胞相关的细胞因子，是宿主对损伤和炎症反应的重要递质，在慢性疾病中起主要作用，具有激活嗜中性粒细胞和趋化嗜中性粒细胞、T细胞和嗜碱性粒细胞等多种功能[29-30]。IL-8已被证实在鼻咽癌细胞和人角质形成细胞中受到miR-203的调控[31-32]。有研究结果显示在糖尿病足溃疡患者中miR-203可以直接靶向并且抑制IL-8的表达[10]。另外研究表明，IL-22可以增强炎症性肠病中肿瘤坏死因子(TNF)诱导的IL-8的表达[33]。OLP患者的黏膜组织、唾液以及血清中均高表达IL-8，且其表达水平与OLP患者的临床严重程度密切相关[34]。因此，推测IL-8可作为评估OLP临床严重程度的可靠指标。但是到目前为止，IL-8在CLP患者机体中是否表达及其表达水平的相关研究还未见报道。本研究结果显示，CLP组皮肤组织中IL-8的表达水平明显高于对照组，并且相关性分析的结果显示，miR-203的表达水平与潜在靶蛋白IL-22及IL-8的表达水平呈显著负相关，IL-22与IL-8表达水平之间呈显著正相关，提示miR-203的异常表达可能导致IL-22、IL-8的表达上调。IL-22与IL-8相互协作共同诱导炎性细胞在炎症部位聚集，放大炎症反应，形成真皮浅层淋巴细胞的带状浸润，促进基底细胞液化变性与细胞凋亡。

综上所述，miR-203可能通过调控其下游靶蛋白IL-22、IL-8的异常表达参与CLP的形成过程，但具体机制还有待扩大样本量进一步深入研究。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

ConflictsofInterest: All authors disclose no relevant conflicts of interest.

伦理批准和知情同意：本研究涉及的所有试验均已通过青岛大学附属医院伦理委员会的审核批准(文件号QYFYWZLL28770)。受试对象已经签署知情同意书。

EthicsApprovalandPatientConsent: All experimental protocols in this study were reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of The Affiliated Hospital of Qingdao University (Approval Letter No. QYFYWZLL28770). Consent letters have been signed by the research participants.

作者贡献：路金明、王莹莹、王宗岭参与了研究设计；杨培、王君、李媛媛参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。

Contributions: The study was designed byLUJinming,WANGYingying, andWANGZongling. The manuscript was drafted and revised byYANGPei,WANGJun, andLIYuanyuan. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.