黄麻叶水解液中总黄酮、黄酮醇类组分含量及酪氨酸酶活性抑制分析

冯湘沅，杨琦，成莉凤，郑科，彭正红，段盛文

（中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205）

黄酮类化合物（Flavonoids）是植物中重要的一种次级代谢产物，包括山奈酚（Kaempferol）、槲皮素 （Quercetin）、杨梅素 （Myricetin）和异鼠李素 （Isorhamnetin）等黄酮醇（Flavonols）类组分物质，其多种生理功能已得到证实，黄酮化合物具有潜在促进健康作用［1-2］。酪氨酸酶（tyrosinase，EC1.14.18.1）是一种含铜的金属氧化还原酶，能催化L-酪氨酸羟基转化成 L-多巴，再氧化形成多巴醌，经一系列的酶促和非酶促反应最终形成黑色素。在人体中，过多黑色素的积累会导致皮肤形成各类色斑等问题，只有通过抑制酪氨酸酶活性，才能减少黑色素的形成，达到美白效果。目前，常用的酪氨酸酶活性抑制剂大多是通过化学方法合成，存在着一定的副作用，而从植物中提取的黄酮类化合物则被认为是理想的酪氨酸酶抑制剂之一［3-5］，因此，寻找安全、高效的黄酮类化合物植物和酪氨酸酶抑制剂在食品及医药方面具有重要意义。

黄麻（Jute）属于锦葵科（Malvaceae）黄麻属（Corchorus）一年生草本植物，约有100多个品种，其中不同品种黄麻叶片中均含有黄麻甙、黄麻酮及多糖类等化学成分，具有一定的抗氧化活性［6］。近年来，黄春梅［7］开展了水和微波法提取菜用黄麻（即长蒴黄麻）中黄酮类化合物的研究；陈如冰等［8］研究了长蒴黄麻总黄酮的提取及其抗氧化性。但尚未见有关不同品种黄麻叶中黄酮类化合物对抑制酪氨酸酶活性的报道。本文对不同品种黄麻叶在甲醇-盐酸、加热回流条件下进行水解，检测分析水解液中总黄酮、黄酮醇类组分含量及抑制酪氨酸酶活性，旨在为黄麻叶功能性食品、美容产品等的深度开发利用提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料

原料：于湖南长沙试验基地采摘的黄麻叶（苗后天数均为28 d），品种名称分别为：黄德深红皮（C．capsularis）、巴麻 72-3（C．olitorius）、中黄麻 4号（C．olitorius）。

试剂：异槲皮素、杨梅素、槲皮素、山奈酚、异鼠李素、芦丁等标准品购自Aladdin公司；福林酚、Tris、HCL、甲醇（色谱纯）、磷酸（色谱纯）、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、L-抗坏血酸/Vc、酪氨酸酶（100KU）均为Aladdin公司产品。

PBS缓冲溶液：A液为称取Na2HPO4·12H2O 71.63 g，用超纯水溶解定容于1000 mL容量瓶中；B液为称取NaH2PO4·2H2O 31.20 g，用超纯水溶解定容于1000 mL容量瓶中；以A∶B＝51∶49的体积比混合，用pH计测定调至pH值6.8。

1.2 仪器

高效液相色谱仪（Dionex Ultimate 3000），C18柱（Thermo Hypersil BDS，250 mm×4.6 mm，5μm），泵（LPG-3400），紫外检测器（VWD-3400），采用变色龙软件采集并处理数据；粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司，FZ102型）；全波长酶标仪（Thermo Scientifc，1510型）；pH计（梅特勒-托利多仪器上海有限公司，FE28型）。

1.3 HPLC检测条件

流动相：V（甲醇）∶V（0.4%磷酸）＝55∶45；流速：1 mL/min；洗脱方式：等度洗脱；柱温：25℃；紫外检测波长：360 nm；进样量：20μL［9］。

1.4 方法

1.4.1 供试样品制备

参照吴柳春等［10］方法并略做修改。将黄麻叶洗净，50℃烘干，粉碎，过45目筛；精确称取1.0 g黄麻叶粉末于250 mL圆底烧瓶中，加入甲醇40mL、盐酸4mL，置于85℃回流水解1.5 h后，冷却至室温；再移入离心管于4500 r/min离心10 min，除去沉淀，收集得到的上清液经0.45μm滤膜过滤，即得水解液，同时设置CK（甲醇-盐酸溶液）对照。

1.4.2 总黄酮含量的测定

标准品溶液配制：精确称取芦丁标准品5 mg，用甲醇溶液溶解后定容于50 mL容量瓶中，得到0.1 mg/mL的芦丁标准溶液；同时适度稀释成不同浓度溶液用作标准曲线测定［11］。

取1mL标准品溶液于10mL的容量瓶中，分别加5% NaNO2溶液0.30mL，摇匀，静置6min；再加10% Al（NO3）3溶液0.30 mL，摇匀，静置6 min；然后再加4% NaOH溶液4.00 mL，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置12 min，于510 nm处测吸光度［11］。

样品总黄酮含量测定方法同上述标准品溶液的测定。

总黄酮质量浓度ρ0（mg/mL）按芦丁标准曲线所得的线性回归方程进行计算。

总黄酮含量以质量分数w0计，数值以毫克每克（mg/g）表示，按公式（1）计算：

式中：ρ0为总黄酮浓度（mg/mL）；n为样品稀释倍数；v为总体积（mL）；m0为粉末质量（g）。

1.4.3 黄酮醇类组分测定

混合标准品溶液配制：准确称取异槲皮素5.0 mg、杨梅素4.2 mg、槲皮素4.5 mg、山奈酚3.6 mg、异鼠李素3.0 mg混合，甲醇溶液超声溶解，定容至50 mL，0.45μm滤膜过滤。同时适度稀释成不同浓度溶液用作HPLC检测，并绘制标准曲线建立线性回归方程。

样品：取1 mL提取液用0.45μm滤膜过滤，用作HPLC检测。

组分质量浓度ρ1（mg/mL）按组分标准曲线所得的线性回归方程进行计算。

组分含量以质量分数w1计，数值以毫克每克（mg/g）表示，按公式（2）计算：

式中：m0为粉末质量（g）；ρ1为组分质量浓度（mg/mL）；v为总体积（mL）。

1.4.4 酪氨酸酶活性抑制测定

参照钱文涛［12］方法并略做修改。按表1取样混匀，37℃恒温10min后，在T2、T4中分别加入酪氨酸酶，再反应10 min，475 nm处测吸光度，同时以CK（甲醇-盐酸溶液）、Vc（黑色素抑制剂）作为对照。

表1 酪氨酸酶活性抑制率测定Table 1 Tyrosinase-inhibiting activities assay

酪氨酸酶活性抑制率以φ计，数值以百分率（%）表示，按式（3）进行计算：

式中：AT1为未加样品和未加酪氨酸酶的反应液的吸光度；AT2为未加样品和加酪氨酸酶的反应液的吸光度；AT3为加样品和未加酪氨酸酶的反应液的吸光度；AT4为加样品和加酪氨酸酶的反应液的吸光度。

1.4.5 IC50值

IC50值是指酪氨酸酶活性抑制率为50%时所需样品的浓度，该值根据线性回归方程计算得出。IC50值越低，表明酪氨酸酶活性抑制能力越强。

1.5 数据处理

试验数据均取平行3次测量值的平均值和标准偏差，同时采用Excel、SPSS 19.0统计软件和Origin 2020b软件进行数据处理并分析。

2 结果与分析

2.1 总黄酮含量

采用Al（NO3）3显色法对不同浓度芦丁标准溶液进行测定，以浓度（x，mg/mL）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标，绘制标准曲线，所得线性回归方程为y＝1.182 2x+0.090 4，R2＝0.999 2。根据线性回归方程和公式得出（表2）：黄德深红皮叶、巴麻72-3叶、中黄麻4号叶的水解液中总黄酮含量分别为92.76、35.51、37.36 mg/g。结果表明，3种黄麻叶中总黄酮含量存在差异。

表2 黄麻叶水解液中总黄酮含量测定Table 2 Determination of flavones in hydrolysate of jute leaves

2.2 黄酮醇类组分与含量

2.2.1 黄酮醇类组分

将5种黄酮醇类组分混合溶解，定容，稀释至适宜倍数，HPLC法检测。以浓度（x，mg/mL）为横坐标，色谱峰面积（y）为纵坐标，制作线性回归方程（表3）。

表3 黄酮醇组分的线性回归方程、相关系数及线性范围Table 3 The linear regression equation，relative coefficient and linearity range of flavonols

样品经干燥、粉碎、水解、HPLC法检测，对照黄酮醇类组分标准品色谱图（图1）分析可知：3种黄麻叶水解液中均含有异槲皮素、杨梅素、槲皮素、山奈酚、异鼠李素以及2种主要未知组分等黄酮醇类组分。

2.2.2 黄酮醇类组分含量

由图1、表4所示，按照黄酮醇类组分混合标准品曲线绘制的线性回归方程及公式计算得出：黄德深红皮叶、巴麻72-3叶水解液中黄酮醇类组分含量均以山奈酚最高，其次为异鼠李素。黄德深红皮叶中的山奈酚和异鼠李素含量分别是巴麻72-3的1.37倍和1.24倍；中黄麻4号叶中黄酮醇组分含量最高的为槲皮素（2.45 mg/g），其次为山奈酚（0.36 mg/g），最低的为异槲皮素（0.09 mg/g）；同时可以看出，中黄麻4号的槲皮素含量分别是黄德深红皮叶、巴麻72-3叶的4.38倍、8.75倍。结果表明，3种黄麻叶均含有黄酮醇类物质，且各组分的含量差异显著。

图1 黄麻叶水解液中黄酮醇类组分色谱图Fig.1 Chromatograms of flavonols in hydrolysates of jute leaves

表4 黄麻叶水解液中黄酮醇类组分含量测定Table 4 Determination of flavonols in hydrolysate of jute leaves

2.3 酪氨酸酶活性抑制

由图2可知，黄德深红皮叶、巴麻72-3叶、中黄麻4号叶水解液黄酮对酪氨酸酶活性抑制率均随浓度的增加而增大，黄德深红皮叶抑制率最高。当水解液黄酮浓度为10 mg/mL时，黄德深红皮叶、巴麻72-3叶、中黄麻4号叶的酪氨酸酶活性抑制率分别达到90.37%、86.29%、82.38%，而CK（甲醇-盐酸溶液）虽然对其也存在一定程度的抑制作用，但相比黄麻叶的抑制率还相当低。

由表5可看出，黄德深红皮叶、巴麻72-3叶、中黄麻4号叶水解液黄酮对酪氨酸酶活性抑制的IC50值分别为4.24、5.04、5.67 mg/mL，即黄德深红皮叶活性抑制能力最强。结果表明，3种黄麻叶水解产物黄酮化合物（包括黄酮醇类物质）具有明显地抑制酪氨酸酶活性作用，但与Vc（黑色素抑制剂）相比，其抑制能力均还较弱。

表5 黄麻叶水解液中黄酮抑制酪氨酸酶活性IC50值比较Table 5 Comparison of IC50 values of tyrosinase-inhibiting activities of flavones in hydrolysate of jute leaves

3 结论与讨论

本研究是对3个不同品种黄麻叶（苗后天数均为28 d）利用甲醇-盐酸溶液在85℃加热、回流1.5 h条件下进行水解，采用Al（NO3）3显色法测得黄德深红皮叶、巴麻72-3叶、中黄麻4号叶的水解液中总黄酮含量分别为92.76、35.51、37.36 mg/g；HPLC法检测得到黄德深红皮叶、巴麻72-3叶、中黄麻4号叶的水解液中均含有异槲皮素、杨梅素、槲皮素、山奈酚及异鼠李素等黄酮醇类组分，其中黄德深红皮叶、巴麻72-3叶水解液中以山奈酚为主要黄酮醇类成分，含量分别为1.38、1.01 mg/g；中黄麻4号叶的水解液中则是以槲皮素（2.45 mg/g）为主要黄酮醇类成分。结果表明，3种黄麻叶均含有较丰富的黄酮类化合物。

作为黄酮类化合物，许多研究均表明其具有较强的抑制酪氨酸酶活性能力，如：李娜［13］研究了红花黄酮类化合物（醇提-微波法提取）浓度为3 mg/mL时，对酪氨酸酶抑制率为63.5%；潘维等［14］分析了槐豆黄酮提取物（碱提-微波法提取）浓度为8.46 g/L时，对酪氨酸酶抑制率为77.40%；宁亚萍等［15］报道了山杏花总黄酮（乙醇-闪式法提取）IC50为2.24～3.08 mg/mL。本研究（水解法提取）结果显示，3种黄麻叶对酪氨酸酶活性抑制能力均随水解液黄酮浓度增加而增大，当水解液黄酮浓度为10 mg/mL时，黄德深红皮叶、巴麻72-3叶、中黄麻4号叶抑制率分别达到90.37%、86.29%、82.38%，且 IC50值相应分别为 4.24、5.04、5.67 mg/mL。与文献［13-15］相比，当黄德深红皮叶水解液黄酮浓度为8.46 g/L时，其对酪氨酸酶活性抑制率（可达81.23%）高于槐豆黄酮提取物，低于红花和槐豆黄酮提取物，而巴麻72-3叶、中黄麻4号叶其抑制率均稍低于上述文献报道。通过比较发现，3种黄麻叶水解液中含有的黄酮类化合物均对酪氨酸酶活性存在一定的抑制作用。因此，黄麻叶具有广阔的深加工开发前景。

在本研究条件下，水解液中总黄酮含量大小排序为黄德深红皮叶＞中黄麻4号叶＞巴麻72-3叶，而酪氨酸酶活性抑制强弱、黄酮醇类组分中的山奈酚及异鼠李素含量多少排序均为黄德深红皮叶＞巴麻72-3叶＞中黄麻4号叶，由此表明，总黄酮含量高的黄麻叶并不一定对酪氨酸酶的抑制作用强，并且这一结果提示酪氨酸酶活性抑制能力可能与水解产物中黄酮醇类某些组分含量多少有关，从中推断，黄麻叶中的黄酮醇类组分中的山奈酚也许是酪氨酸酶活性抑制的主要成分之一，这一结论与文献［16-17］报道相吻合。然而，从黄酮醇类组分色谱图分析中发现，不同品种黄麻叶水解产物中出现2种未知组分，其峰面积（含量）大于已知5种组分，至于这2种未知组分是否属于黄麻叶中的黄酮醇类组分或者与酪氨酸酶抑制能力存在着直接关联抑或协同作用，还有待于进一步探讨。