中国克虎天牛属整合分类

郭书含，罗顺刚，钟 问，康 宁，胡红英

(新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046)

0 引言

【研究意义】克虎天牛属Cleroclytus隶属于鞘翅目Coleoptera、天牛科Cerambycidae，已知种类仅分布于天山山区。中国已记录2种，即新疆克虎天牛CleroclytuscollarisJakovlev,1885和沟胸克虎天牛CleroclytusstrigicollisJakovlev , 1990[1]，克虎天牛危害树木生长。在西天山野果林分布的克虎天牛幼虫钻蛀、危害野生果树枝干及根系，导致树势衰弱，严重时致使树木迅速枯萎死亡。查明克虎天牛分布及危害状况，对施以针对性的措施有效预防和遏制其危害有重要意义。【前人研究进展】天牛是危害严重且防治困难的一类林木害虫[2]，天牛的物种鉴定在昆虫学和林业生态建设上受到广泛重视[3]。梁铁等[4]在乌鲁木齐发现了沟胸克虎天牛CleroclytusstrigicollisJakovlev(称为“沟胸细条虎天牛”)危害林木果树。Danilevsky[5]认为沟胸克虎天牛与分布于新疆伊犁河谷的新疆克虎天牛CleroclytuscollarisJakovlev属于同一种，二者应为异名，但未提供明确的依据。DNA条形码技术广泛应用于昆虫鉴定、隐存种描述及系统发育分析[6]。Stauffer[7]实现了欧洲7种齿小蠹的快速准确鉴定；郑斯竹[8]构建了天牛科5个亚科160种的基于COI基因序列的DNA条形码数据库，进一步完善了天牛科的快速鉴定技术；陈梦义[9]利用墨天牛属中的8个种进行COI扩增，依据碱基位点排列和组成差异，区分不同种类；林晓佳[10]应用PCR直接测序法比较不同地理来源的光肩星天牛的线粒体DNA的COI基因，发现美国发生的光肩星天牛并非由中国传入；李京[11]通过研究天牛科66 种天牛的线粒体基因序列特征，初步弄清楚了各类群之间的亲缘关系。天牛科昆虫雌性生殖器种间差异稳定且明显，能够作为物种鉴定的参考。Tanner[12]对7种天牛的雌性生殖器进行了比较形态学研究；Arakawa[13]报道了紫天牛属Purpuricenus两种的雌性生殖器，认为雌性生殖器的特征对物种鉴定更为有用；王文凯[14]比较了绿虎天牛属Chlorophorus的雌性生殖器，认为雌性生殖器结构是可靠的分类依据；任杰群[15]比较了脊虎天牛属Xylotrechus八个种的雌性生殖器，发现骨杆、交配囊、受精囊的形状等特征具有重要的分类学意义。【本研究切入点】新疆克虎天牛与沟胸克虎天牛皆分布于新疆，且仅凭形态特征难以区分，是否为同一种也长期存在争议。目前国内外对于克虎天牛属物种的研究主要集中在形态分类学方面。新疆地区分布的克虎天牛在形态上缺乏明显差异，需要使用分子生物学方法加以区分。亟需寻找并明确其分类特征，进而厘清其物种组成。【拟解决的关键问题】结合DNA条形码技术与比较形态学方法，对分别采自新疆乌鲁木齐市和伊犁哈萨克自治州新源县阿勒玛乡改良场植物园的克虎天牛进行研究，为其准确鉴定提供依据，并为该属物种的分类和对其防治相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

新疆克虎天牛成虫于2017年7月19日采集于新疆伊犁哈萨克自治州新源县阿勒玛乡改良场植物园，沟胸克虎天牛成虫于2020年6月15日采集于新疆乌鲁木齐市新疆大学校内。从GenBank获得咖啡脊虎天牛Xylotrechusgrayii和暗褐断眼天牛TetropiumFuscum的3条序列作为外群，用于对比分析。表1，表2

表1 标本采集与保存方式Table 1 Collection and preservation of specimens

1.2 方 法

1.2.1 雌性外生殖器标本的制作、观察及保存

将克虎天牛成虫放入100%无水乙醇中使虫体软化，标本腹部取下放入清水中煮沸3 min，在解剖镜下用解剖针取出雌性生殖器；将取出的生殖器放入10%NAOH溶液中煮沸3 min左右(视生殖器的大小和骨化程度而定)，取出放入盛有清水的培养皿中，在解剖镜下进行分离解剖和清洗，得到洁净完整的雌性外生殖器[16]，使用体视显微镜观察雌性生殖器的形态特征，并拍照。将雌性生殖器置于木馏油中脱水，再浸置于丁香油中固定，用加拿大树胶封片永久保存。

表2 使用的GenBank的数据Table 2 The sequence data used in GenBank of thisresearch

1.2.2 DNA提取

将克虎天牛剩余的身体部位置于2 mL离心管中，加入研磨钢珠后，利用高效组织研磨仪研磨2 min，随后利用OMEGA试剂盒说明书操作提取克虎天牛DNA。

1.2.3 DNA纯度及质量浓度检测

每个样品取1 μL DNA于生物分光光度计(NANODrop1000)测定波长260、280 nm的光吸收值(OD)，以无菌水为对照，并自动计算OD260/OD280的比值以及相应DNA浓度值。

1.2.4 目的片段扩增、检测及测序

选用线粒体基因细胞色素氧化酶I(COI)的部分片段作为分子标记，引物选用扩增该片段的通用引物LCO1490/HCO2198，上游引物碱基序列为：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’,下游引物碱基序列为：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。

PCR反应体系总体积为25 μL；上、下游引物各1 μL(引物浓度10 μmol/ L)，2×PCR Mix预混液12.5 μL，DNA模板3 μL，用灭菌双蒸水补足体积至25 μL。扩增程序：94℃预变性4 min，然后进行35个循环，94℃变性1 min，40℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环结束后72℃延伸10 min，4℃保存。

PCR扩增反应结束后，取2 μL PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳20 min分离扩增产物，电压120V。电泳结束后, 在UVP凝胶成像系统GDS7600(Gel Documentation Systems)下观察拍照。委托上海生工生物工程股份有限公司进行PCR产物双向测序。

1.2.5 目的序列拼接与确认

将各样品COI序列测序结果导入DNAStar中的SeqMan分析软件中进行拼接匹配校正。使用DNAMAN软件分析进行核苷酸序列。通过MEGA 7.0分析计算碱基含量。基于Kimura-2-Parameter模型，用极大似然法(MaximumLikelihood)构建分子系统树，1 000次循环估计系统树中节点的自举置信水平(Bootstrap Confidence Level,BCL)。

2 结果与分析

2.1 新疆克虎天牛和沟胸克虎天牛形态特征

研究表明，从外部形态特征很难将二者区分，仅触角长和体长比，前胸背板颜色和刻纹等细节存在些微差异 。采自新疆伊犁哈萨克自治州新源县阿勒玛乡改良场植物园的克虎天牛暂定为新疆克虎天牛，采自新疆乌鲁木齐市的克虎天牛暂定为沟胸克虎天牛。表3，图1

2.2 新疆克虎天牛和沟胸克虎天牛雌性生殖器特征比较

研究表明，与大多数天牛一样，克虎天牛雌性生殖器包括产卵器和内生殖器两部分，产卵器基部开口为生殖孔。产卵器由肛侧板、1对负瓣片、1对基腹片、端突构成。除末端的端突外，其余部分都有坚固的细长骨杆。肛侧板骨杆大多较直。基腹片末端分离成两个近圆柱形的部分，称为基腹片突。负瓣片位于肛侧板的端部，较短。基腹片位于负瓣片下方，在基部左右各有1根基腹片骨杆。内生殖器部分包括受精囊、交配囊等组成。交配囊着生在阴道的前端，呈膜质囊状。受精囊呈膜质肾形。图2

注：A：沟胸克虎天牛B：新疆克虎天牛

表3 2种克虎天牛形态特征比较Table 3 Comparison of traditional morphologal charactersoftwo species of Cleroclytus

A：新疆克虎天牛 B：沟胸克虎天牛

表4 克虎天牛属雌性生殖器特征比较Table 4 Comparison of female genital organs o in

新疆克虎天牛和沟胸克虎天牛肛侧板骨杆的雌性生殖器结构非常相似，而新疆克虎天牛比沟胸克虎天牛肛侧板骨杆和负瓣片骨杆分段稍为明显。表4

2.3 DNA质量与浓度比较

研究表明，无水乙醇-20℃冷藏的沟胸克虎天牛浓度较高，针插干标本室温保存的新疆克虎天牛DNA浓度较低，但DNA样品OD260/280值均在1.6～1.9。DNA纯度达到要求，属于高质量的DNA，可以达到常规PCR的要求。表5

2.4 克虎天牛COI基因条形码

2.4.1 COI基因PCR扩增后的电泳结果

研究表明，1～3条带为新疆克虎天牛，4～6条带为沟胸克虎天牛。样本条带亮度强且单一，无其他带干扰，且CO I 基因序列分子量为670 bp 左右。图3

表5 DNA质量与浓度Table 5 The purity and concentration of DNA samples

图3 克虎天牛COI基因PCR产物电泳Fig.3 Electrophoresis of COIgene PCR products of Cleroclytus

2.4.2 克虎天牛基因组序列组成

研究表明，新疆克虎天牛样本的A+T含量分别为63.44%、63.64%、63.64%，平均含量是63.57%，各沟胸克虎天牛样本的A+T含量分别为63.43%、63.63%、63.63%，平均含量是63.56%。各新疆克虎天牛样本的G+C含量分别为36.56%、36.36%、36.36%，平均含量是36.43%。各沟胸克虎天牛样本的G+T含量分别为36.57%、36.37%、36.37%，平均含量是36.44%，A+T的平均含量明显高于G+C的平均含量，表现较强的A/T偏倚，新疆克虎天牛不同样品基因序列相似性达到99.93%，沟胸克虎天牛不同样品基因序列相似性达到99.95%。相似性高达99.60%，仅有部分碱基存在差异，测序的新疆克虎天牛与沟胸克虎天牛样本应属于同一物种。图4～6

图4 三只新疆克虎天牛的COI基因序列对比Fig.4 COI gene sequence comparison between threeCleroclytus collaris Jakovlev

图5 三只沟胸克虎天牛的COI基因序列对比Fig.5 COI gene sequence comparison between threeCleroclytus strigicollis Jakovlev

图6 新疆克虎天牛与沟胸克虎天牛的COI基因序列对比Fig.6 COI gene sequence comparison between Cleroclytus collaris Jakovlev and Cleroclytus strigicollis Jakovlev

2.4.3 遗传距离

研究表明，新疆克虎天牛平均遗传距离是0.27%，沟胸克虎天牛平均遗传距离是0.13%，新疆克虎天牛与沟胸克虎天牛平均遗传距离是0.6%，新疆克虎天牛与沟胸克虎天牛实为同一物种。表6

2.4.4 系统发育树的建立

研究表明，新疆克虎天牛和沟胸克虎天牛聚为一支，与外群分开。图7

图7 基于COI基因序列构建的ML树Fig.7 Construction of ML tree based on COI gene sequence

表6 各个样本之间的遗传距离Table 6 The genetic distance between examples

3 讨 论

新疆克虎天牛前胸背板具纵沟纹和刻点，在基半部刻点比纵沟纹占优势，而沟胸克虎天牛前胸背板上的刻点仅少量分布于后部[1,4,17]。A+T的平均含量明显高于G+C，表现较强的A/T偏倚，与昆虫线粒体基因碱基组成的规律相符合[18]。新疆克虎天牛与沟胸克虎天牛平均遗传距离是0.6%，遗传距离<2%[19]，Danilevsky[5]认为沟胸克虎天牛与新疆克虎天牛系异名，而陆水田[1]、华立中[20]、王直诚等[21]将其视为2个物种，主要依据在于前胸背板刻纹或刻点。研究结合DNA条形码技术与形态学比较方法相结合，对新疆克虎天牛与沟胸克虎天牛进行整合分类研究。外部形态以及雌性外生殖器形态解剖未发现明显形态差异，个别微小差异可认为是个体间差异，序列相似性以及遗传距离分析均支持二者实为一种，而系统发育树虽与外群分开，但两个地点的克虎天牛各聚为一支，可能是由于种内或者地理分布型的差异。

获取高质量的基因组DNA是开展分子生物学的前提和基础[22-23]。研究使用的干制克虎天牛标本于室内常温干制保存，因克虎天牛体壁坚硬，透水透气性差，从而导致其体内部分DNA降解，可能导致提取自此类标本的DNA浓度较低。从-20℃无水乙醇保存的标本提取出的DNA浓度较高，可能是因为乙醇能够渗透入昆虫组织细胞使蛋白质凝固，使多种水解酶丧失活性，降低DNA被分解的程度[24]。分子生物学手段的引入部分降低了分类学研究中对于鉴定者的经验要求[25]。国内外对DNA条形码编码技术进行了广泛的研究，在昆虫种类鉴定方面得到了更好的应用[19]。在一定程度上缓解了由于传统分类学从业者数量减少对生物分类研究的制约[26]。

4 结 论

克虎天牛的COI基因序列长度约为670 bp，新疆克虎天牛与沟胸克虎天牛序列相似性达到99.60%，二者的平均遗传距离是0.6%，可确定二者为同一种，与形态学鉴定结果基本相吻合。应将沟胸克虎天牛视为新疆克虎天牛的异名，确定分布于伊犁和乌鲁木齐的克虎天牛均为新疆克虎天牛。